微阵列分析FOR酿酒酵母</em
Summary
在这个协议中，在酵母中的基因表达（<em>酿酒酵母</em>）是改变曝光后添加过氧化氢（H诱导的氧化应激<sub> 2</sub> O<sub> 2</sub>），氧化剂。
Abstract
在这个协议中，酵母（ 酿酒酵母 ）中的基因表达改变曝光后添加过氧化氢 （H 2 O 2），氧化剂诱导的氧化应激。在实验过程中，酵母是在1/2X YPD 3X葡萄糖肉汤培养48小时。文化是分割成一个控制和治疗组。实验文化是用0.5毫米的H 2 O 2汉克斯治疗的缓冲液（HBSS）1小时。控制文化是唯一的HBSS治疗。总RNA是从两种不同的文化提取和转换通过一个多步骤的过程中，以生物素标记的cRNA产品。最后的合成产品带回UVM芯片的核心设施，Affymetrix公司的酵母基因芯片杂交。由此产生的基因表达数据上传到生物信息学数据分析软件。
Protocol
<p class="jove_title"> 1。隔离的总RNA从<em>酿酒酵母</em>使用酶法裂解</p><ol><li>准备一个无RNase的工作区，使用核糖核酸ZAP（Ambion公司）。</li><li>加入1毫升的无RNase水直接lyticase小瓶10 U / UL的解决方案作最后的工作准备新的工作lyticase试剂。涡和颠倒几次，以确保完全混合。这10个单位/μL的解决方案是稳定的12小时。</li><li>准备新鲜的DNA酶我Qiagen公司的DNA酶试剂盒和存储解决方案，使用冰。</li><li>标签为1.7毫升的离心管中与您的身份信息。管转移到适当的酵母培养物1.5毫升。</li><li>离心管在5000 XG（全速约3 / 4）在室温下2分钟。小心取出上清液（互不干扰颗粒）使用微量和上清液。<strong>****重复步骤4，如果颗粒大小是太小或如果由导师表示.****</strong</li><li>加入1000μLDEPC水颗粒，旋涡，离心2分钟，在5000 XG。上清液。删除从酵母颗粒尽可能多的液体。</li><li>添加下面的酵母沉淀和旋涡混合。<br /><table border="1"><tbody><tr><td> SGbuffer</td><td> 10μL</td></tr><tr><td> Lyticasesolution（10u/μl）</td><td> 30μL</td></tr></tbody></table</li><li>在室温下30分钟孵育。</li><li>轻轻旋流管，每10分钟产生原生质球。原生质球轻轻必须处理。检查，在显微镜下观察完成spheroplasting酵母。虽然研究的显微镜玻片上的酵母，添加少量的0.1％SDS导致酵母膨胀，形成完美的球体（即使出芽细胞）。这表明细胞壁已被消化。</li><li>添加350μLB – RLT缓冲管和涡<strong>大力</strong> 1分钟。确保您的管紧紧握住盖子封顶封闭而震荡。此过程将裂解原生质球。</li><li> 250μL100％的乙醇添加管，并简要涡。沉淀后形成的乙醇此外，但这不会影响RNA的集合。</li><li<strong>收集的RNA：</strong>标签的RNeasy旋转柱与您的身份informationand仔细转移从第10步的解决方案使用微量离心柱。要小心不要碰到吸管尖端的硅膜。关闭管和全速离心15秒。样品中的RNA，将坚持以硅胶膜离心柱。</li><li>从收集管中取出离心柱。吸取液体的通过（收集管中的液体）到离心柱离心一次。倒掉收集管（通过流体流动），并将其放置到一个新的2ml收集管的离心柱。</li><li>添加350μLRW1缓冲区的离心柱。这个解决方案是用来洗的RNA和去除盐类和溶解的细胞碎片。关闭管和全速离心15秒。</li><li<strong>消化的DNA：</strong>删除从离心机的离心柱，打开管盖，加80μL的DNA酶我溶液的离心柱膜的中间。这一步将消化基因组DNA样本中的任何。关闭列盖，并在室温下孵育15分钟。</li><li>离心柱转移到一个新的2ml收集管。</li><li<strong>清洁洗涤RNA：</strong>添加350μLRW1缓冲区的离心柱和全速离心15秒。</li><li>弃掉收集管，并将其放置到一个新的2ml收集管的离心柱。</li><li>添加500μL的RPE缓冲液的离心柱，洗上的硅膜的RNA。关闭管和离心机全速15秒<em>。</em</li><li>弃掉收集管，并将其放置到一个新的2ml收集管的离心柱。</li><li>硅膜洗净，再增加另外500μL的RPE缓冲区的离心柱。关闭管和全速离心15秒。</li><li>放置在一个新的2毫升收集管，在1分钟的全速离心离心机离心柱，以确保任何残余的液体是从硅膜中删除。</li><li<strong>恢复的RNA：</strong>的RNeasy离心柱转移到一个新的1.7 ml离心管已标记的样品信息。请注意接下来的几个步骤的开放，将留给新的管帽。</li><li>小心吸取30μL无RNase水<strong>直接到中心</strong>硅膜。<strong>不要用吸管尖端的硅膜（见图表）</strong>。仔细一看，在执行此步骤。用双手引导吸管。确保水均匀分布在膜。</li><li>离心柱在室温下孵育1分钟。全速离心30秒。</li><li>小心地转移30μL在1.7 ml管到上述步骤22相同的自旋列硅膜中心恢复。将列在同一1.7 ml收集管中，1分钟，在室温下孵育。离心1分钟全速。这种双重洗脱确保RNA的最大金额是从膜回收。</li><li>标签两个新的1.7毫升，用您的身份信息离心管中，所有回收的RNA样品传输管。</li><li> 4μL此示例转移到其他标记管。此示例将运回的UVM Nanodrop定量和定性评估RNA（这是验证在现场进行，在参加研究所的核糖核酸（RNA）的定量和定性分析）。</li><li>所有样品置于冰上。</li><li<strong> RNA定量：</strong>使用的Eppendorf分光光度计，分光光度计测量RNA样品的吸光度在1到50的稀释（加入1μl样品49μlH<sub> 2</sub> O）。</li><li>评估RNA的质量，使用的E -凝胶（Invitrogen）的1.2％，预制琼脂糖凝胶电泳。</li><li<strong> RNA定性分析：</strong>设置的E -凝胶电泳仪。预运行2分钟的凝胶，根据制造商的过程。预运行后，取出凝胶梳，并添加14μL水，每口井，每个样品加入1μl。充分混匀，向上和向下吹打。在一个大小比较后（BioLine简易梯子，我大小标准或Novagen公司PCR标记），使用一个适当大小的DNA梯状。记录在每个车道的样品。运行20分钟的凝胶。</li><li>凝胶的照片。</li></ol><p class="jove_title"> 2。第一链cDNA合成</p><ol><li>标签0.5 ml PCR管中，用您的身份信息。从上述实验确定从RNA的浓度，计算出样品的体积，以获得3.0微克。这一数额转移到管。加入足够的无RNase水带来的体积11.0 UL。</li><li>添加1.0μLT7以oligo（dT）<sub> 24</sub>试剂管。请一定要特别注意在这一步吸管尖卷，以确保所有的试剂转移。涡旋管和离心5秒的全速。管放置在一个热循环在70 ° C 10分钟。</li><li>虽然70℃孵化过程中，准备在一个新的管的第一链主组合。一定要添加下列试剂<strong>为了，</strong>涡和全速离心5秒和管置于冰上。<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong>第一链主的组合：</strong</td></tr><tr><td> FirstStrandBuffer5X</td><td> 4μL</td></tr><tr><td> 0.1MDTT</td><td> 2μL</td></tr><tr><td> 10mMdNTP</td><td> 1μL</td></tr><tr><td> SuperscriptII</td><td> 1μL</td></tr></tbody></table<br><li>经过70 ° C在孵化第2步完成后，在42 ° C 8μL第一链主在第3步混合添加一个热循环管和孵育60分钟。当第一链合成孵化完成后，将管上的冰。在此孵化，准备第二链主结构。</li></ol><p class="jove_title"> 3。第二链cDNA合成</p><ol><li>请在一个新的管下面的第二个组成部分预混。保持它在冰上。涡和离心机的所有试剂使用前。在列出的顺序添加试剂。<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong>第二个组成部分预混</strong</td></tr><tr><td> DEPC水</td><td> 91 UL</td></tr><tr><td> 5X第二链缓冲</td><td> 30 UL</td></tr><tr><td> dNTPs（10MM）</td><td> 3 UL</td></tr><tr><td<em>大肠杆菌</em> DNA连接酶（10U/ul）</td><td> 1 UL</td></tr><tr><td<em>大肠杆菌</em> DNA聚合酶I（10U/ul）</td><td> 4 UL</td></tr><tr><td<em>大肠杆菌</em核糖核酸酶H（2U/ul）</td><td> 1 UL</td></tr></tbody></table</li><li>旋涡全速管和离心5秒。</li><li当42℃孵化完成后，转让所有130μL的第二个组成部分预混含有RNA和第一链试剂到样品管。在室温下5秒的旋涡和离心机。在16 °彗星在热循环管孵育2小时。</li><li>在结束2个小时的潜伏期，而样品仍然是在16 ° C，加入2μLT4 DNA聚合酶试剂管。简言之涡和离心管和孵化在16℃，不超过5分钟。孵化长5分钟，可能会减少的cDNA的T4聚合酶3'to 5'exonuclease活动的质量。</li><li>在5分钟的孵化结束时，加入10μL0.5 M EDTA停止T4 DNA聚合酶反应。存放于-20 ° C的管</li></ol><p class="jove_title"> 4。沉淀的cDNA</p><ol><li>离心一分钟全速阶段锁凝胶管，以确保凝胶在试管底部。<strong>不涡锁相管</strong>。</li><li>添加162μL<strong>底层</strong>从pH 8.0 Tris缓冲5秒酚/氯仿/异戊醇（PCI）的第二链cDNA合成反应管和涡的内容混合的内容（从上述实验中的总体积的cDNA合成步骤162 UL PCI步骤需要等量的水相和有机混合物）。</li><li>所有的cDNA PCI混合物转移到锁相凝胶管使用micropipet。<strong>不要旋涡振荡</strong>锁相硅胶管。</li><li>离心2分钟的全速。</li><li>标记一个新的1.7 ml离心管。使用micropipet锁相硅胶管从顶层转移的新标记的1.7 ml管。尝试尽可能收集到的一层。</li><li>添加以下的1.7毫升离心管和旋涡。<br /><table border="1"><tbody><tr><td>乙醇（100％）</td><td> 405 UL</td></tr><tr><td> NH<sub> 4</sub>醋酸</td><td> 80 UL</td></tr><tr><td>颗粒涂料</td><td> 1 UL</td></tr></tbody></table</li><li>放置在离心管与管面临的铰链和全速离心20分钟，在室温。</li><li>轻轻取出小心，不要去打扰的cDNA颗粒的离心管。颗粒应该是粉红色，约一粒盐和上管下的铰链一边的大小。置于冰上，并立即进行下一步。</li></ol><p class="jove_title"> 5。清洁的cDNA颗粒</p><ol><li>使用P1000的micropipet，小心地从管中删除所有的上清液。要小心不要去打扰颗粒。记住，沉淀是你的样品！</li><li>加入500μL80％冷乙醇（-20℃保存<sup> °</sup> C冰箱）管。轻轻盖管倒置慢慢几次。观看您的颗粒非常密切。如果颗粒变得超脱，地方管在机架和颗粒定居底部。或者，你可以管离心15秒全速颗粒回落到试管底部。</li><li>使用P1000的micropipet，小心地取出乙醇非常小心，不要打扰沉淀。提示管，使尽可能去除尽可能多的液体。</li><li用80％乙醇的新等分>重复步骤2和3。</li><li最后，通过使用P1000的micropipet中删除所有可能的乙醇。全速离心管5秒，使用P20的micropipet，除去乙醇的最后几微升。我们的目标是尽可能多的乙醇，删除，而不会干扰颗粒。</li><li>开管放置在机架或烘干箱为10-20分钟，其余的乙醇蒸发。干燥后的颗粒很容易丢失，一旦干。 Becareful处理管轻轻。完成后，接近上限。可视化的干燥颗粒，以确认它是目前在管。</li><li>重悬在22μl无RNase水和管置于冰上的沉淀。</li></ol><p class="jove_title"> 6。 InVitroTranscription（IVT）</p><ol><li>恩佐bioarray套件包含了所有需要准备从cDNA生物素标记的cRNA的试剂。<br />一个主mixfor整个类将被作为follows.The教练准备将准备混合或指定类的人。这项工作必须在无RNase的地区。<br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> AMT /样品</td><td>＃样品</td><td>共</td></tr><tr><td>试剂1 [10X反应缓冲]</td><td>4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td[10X Biotinnucleotides>试剂2]</td><td>4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>试剂3 [10倍的数码地面电视]</td><td>4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td[10倍的核糖核酸酶抑制剂>试剂4]</td><td>4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>试剂5 [20X T7 RNA聚合酶]</td><td>2μL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>总容积</td><td> 18μL</td><td></td><td></td></tr></tbody></table<br><strong>注意：</strong>准备足够的样本数加一预混。这将确保足够的移液的目的。</li><li>标签0.5 ml PCR管中。在管和吸管高达结合以下，几次下来，组合。在离心机中旋转5秒的全速所有试剂，试管底部。<br /><table border="1"><tbody><tr><td> cDNA的混合物</td><td>22μl</td></tr><tr><td> Enzomastermix [fromabove]</td><td>18μl</td></tr><tr><td> TotalVolume</td><td>40μl</td></tr></tbody></table</li><li在37 ° C for16小时热循环管。当反应完成后，储存在-20 ° C的样本</li></ol><p class="jove_title"> 7。清洁的生物素化的cRNA</p><ol><li>整个的cRNA样品转移到一个新的1.7 ml离心管。无RNase水加入60μL和350μL的RLT缓冲和5秒的旋涡。</li><li>再加入250μL100％的乙醇和旋涡。</li><li>标签的RNeasy旋转柱和整个的cRNA样品转移到列。小心不要触摸吸管尖端的硅膜。关闭盖子，离心15秒全速。</li><li>从收集管中取出离心柱。吸管穿过液体（液体收集管）到离心柱和离心15秒后重试。</li><li>放入一个新的2毫升收集管和吸管上的旋转列500视网膜色素上皮缓冲液的离心柱。关闭管和全速离心15秒。通过液体倒掉收集管通。放置到一个新的2ml收集管的离心柱。</li><li>添加另外500μL的RPE缓冲区的离心柱。</li><li>传送到一个新的收集管的离心柱和执行一列“晒”在2分钟的速度旋转。</li><li>标签一个新的1.7 ml离心管，用您的身份信息。离心柱转移到该管。</li><li吸取30μL无RNase水到中心的RNeasy硅胶膜和孵化房间温度为1分钟。关闭管和离心1分钟全速。</li><li>小心地转移30μL在1.7 ml管到相同的自旋列的RNeasy硅胶膜中心恢复。将列在相同的1.7 ml收集管中，1分钟，在室温下孵育。离心1分钟全速。这种双重洗脱确保cRNA的最大金额是从膜回收。</li><li>传送到一个新的1.7毫升离心管和标签，生物素标记的干净的cRNA适当。</li><li>确定的cRNA浓度上面所述在RNA分离过程中使用相同的步骤。记录的浓度和260/280的比例。</li></ol><p class="jove_title"> 8。碎片的cRNA的目标准备</p><ol><li>标签0.5 ml PCR管中，用您的身份信息。 5微克的同等数额的cRNA的传输管。加入足够的无RNase水带来总量的16.0 UL，然后添加4.0 5X碎片缓冲液管。应在管总量20.0 UL。</li><li>涡管和离心10秒。在94 ° C孵育30分钟，在一个热循环管。在冰上，把下面的潜伏期。</li></ol><p class="jove_title"> 9。评估零散和不分段的cRNA，用琼脂糖凝胶</p><ol><li>设置的E -使用预制1.2％琼脂糖凝胶电泳仪。预运行2分钟的凝胶，根据制造商的建议</li><li>每孔加入14μL水在E -凝胶。</li><li每个样品添加2μL每口井和吸管，拌匀。分析每个样品的零散和不分段的cRNA。最好是负载在相邻车道的样本（零散和不分段）。记录每个样品的身份，在每条车道。</li><li>一巷凝胶加入4μL的DNA阶梯（BioLine简易梯，我的大小标准或Novagen公司PCR标记）</li><li>运行20分钟的凝胶。</li><li>可视化在透射电子凝胶。以凝胶图像。</li></ol><p class="jove_title"> 10。 2.0酵母基因芯片杂交</p><p class="jove_step">代表性的成果：</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong>图1。</strong>扫描Affymetrix的酵母基因芯片图像（Affymetrix基因芯片操作系统软件（GCOS））</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong>图2。</strong>所有遗传成绩单（约6700个基因）的二维散点图，比较的控制和处理酵母数据。每个点都代表一个单一的基因。在紫颜色的基因表明基因差异表达，而在红色的基因是不。差异表达基因的说明标在相应的传说，而且大多数是在细胞周期控制在这个例子中涉及。 （Affymetrix基因芯片操作系统软件（GCOS））</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig3.jpg" alt="Figure 3" ><strong>图3。</strong这一流程图差异表达基因在受影响的生物途径。红星表明该基因在减数分裂途径，下调基因。><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig4.jpg" alt="Figure 4" ><strong>图4。</strong火山情节代表性的结果。与p值0.05和1.5倍表达的变化切断切断，控制和处理的样品进行了比较。此图是生成使用Geospiza>
Discussion
<p class="jove_step">应用和意义。</p><p class="jove_content">佛蒙特遗传学网络推广方案，在佛蒙特大学，进行本科推广到全州8个合作伙伴学士学位学院。而VGN宣传核心的目标是暴露在佛蒙特州国家的最先进的科学技术和资源使用的动手经验的本科生。芯片模块的描述是在2003年和随后升级。它已经提供了一个小型的课程或集成到现有的实验室课程参与机构。</p><p class="jove_content"该项目的研究型大学的核心和本科院校之间，促进教育和研究合作。芯片推广整个国家增强了课程和创建的核心设施，教师和学生的研究和交流机会。</p><p class="jove_content">作为本科教师采用的方案，并鼓励他们设计独特的实验，只要有适当的Affymetrix公司的基因芯片和注释可用。此模块的所有信息，包括实验室手册，参考资料和PowerPoint演示文稿，可在网上（佛蒙特州遗传学网络，2008年）。</p><p class="jove_step">关键步骤：</p><p class="jove_content"<em> Spheroplasting：</em>重要的是，在显微镜下观察成功spheroplasting。的SDS的使用是非常有益的，因为它会导致酵母肿胀在球体。重要的是观察出芽细胞以及形成球体。如果部分spheroplasting是观察，lyticase延长治疗建议。</p><p class="jove_content"<em>颗粒清洁：</em在沉淀反应和随后的乙醇洗涤步骤，它是很容易失去的cDNA颗粒。格外小心，一丝不苟的颗粒是势在必行。</p><p class="jove_content"<em>水应用膜的中心：</em>在从膜的RNA洗脱步骤，它是重要的“唧”的水30μL直接向中心的硅膜。如果没有完成，这是可以离心列，并造成elutant可以重新申请再次硅膜。这可以根据需要多次重复。</p><p class="jove_step">修改和替代产品：</p><ol><li>替代核糖核酸（RNA）清理列可以被替换。例如USB准备缓解和Invitrogen公司的纯链接RNA试剂盒，和欧米茄核糖核酸（RNA）的清理工具包，仅举几例。</li><li>裂殖酵母是一个可选的酵母。 Affymetrix基因芯片包含在同一芯片上的两个基因</li><li>各种治疗方法和时间都可以使用。这可能包括药物治疗，温度处理，抗氧化剂等治疗时间也可能调整。</li><li> DNA酶处理可能不需要，因为描述的方法采用的Oligo（dT）引物的使用。</li><li它不需要执行关闭具有相同的30μL等分列双洗脱的RNA。一旦几乎总是充足的。这是建议，以保证得到完全恢复。此外，从柱洗脱的RNA用于水，可预先加热到65 ° C，以进一步加强恢复硅胶柱RNA的能力。</li><li>的许多方法可用来量化RNA。 Eppendorf公司和Nanodrop只有被选中其易用性和测试的准确性。</li><li>琼脂糖凝胶电泳进行使用标准的实验室设备。 E -凝胶是不是必需的，但，是可取的，因为它是核糖核酸酶自由，不需要等待凝胶凝固时间。</li><li>订购产品的详细信息，已经提供。然而，许多一般的试剂，可以从多个供应商订购。</li><li>一周期的cDNA试剂可单独购买，如果是这样的，更具成本效益。</li><li>还有其他的目标准备的方法，但我们觉得这一个为学生提供更多的教学机会。</li></ol>
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"佛蒙特大学，佛蒙特遗传学网络。本刊物是由佛蒙特州遗传学网络，通过赠款编号P20 RR16462从布林计划和INBRE theNational研究资源中心（NCRR），美国国立卫生研究院的一个组成部分（NIH）的计划项目编号P20 RR16462 。其内容完全是作者的责任，并不一定代表NCRR或美国国立卫生研究院的官方意见。</p><p class="jove_content">我们想感谢他们的协作和投入，在完善这个模块卡斯尔顿州立学院，绿山学院，约翰逊州立学院，林登州立学院，万宝路学院，Middlebury学院，诺威治大学和圣迈克尔学院，我们所有参与推广机构。</p>
Materials
| General Laboratory Equipment | Company | Product number |
| Spetrophotometer | ||
| Thermocyler | ||
| Microcentrifuge | ||
| Vortex | ||
| Stir Plates (2) | ||
| P-10s pipettors | ||
| P-20’s pipettors: | ||
| P-200’s pipettors: | ||
| P-1000’s pipettors: | ||
| Camera and transilluminator | ||
| Supplies – recommended | ||
| E-Gel Apparatus | Invitrogen | G6000-08 |
| E-Gels | Invitrogen | G6018-02 |
| Axygen 1.7 ml. Clear | Krackler | 383-MCT175C |
| Axygen 0.5 ml clear tubes | Krackler | 383-MCT060C |
| Axygen 2ml capture tubes | Krackler | 383-MCT200NC |
| boxes of P-10 ART tips: | CLP | BT10XL |
| Boxes of P-100 ART tips: | CLP | BT200 |
| Boxes of P-20 ART Tips: | CLP | BT20 |
| Boxes of P-1000 ART Tips: | CLP | BT1000 |
| Yeast Chips | ||
| General Laboratory Supplies | ||
| 25 ml sterile disposable pipets- | ||
| 5ml sterile disposable pipets- | ||
| Microfuge tube racks | ||
| KimWipes: | ||
| Lab Coats | ||
| Stir Bars | ||
| Culture flasks | ||
| Innoculating loops | ||
| Sharpies | ||
| Gloves | ||
| Autoclave tape | ||
| Stirrer bars | ||
| Reagents | ||
| 30% Hydrogen Peroxide | EMD Millipore | 386790 |
| HBSS without Ca, Mg, or dye | Sigma-Aldrich | H6648-100ml |
| Qiagen Rneasy Mini Kit: | Qiagen | 74104 |
| Qiagen DNase Kit: | Qiagen | 79254 |
| Rnase Remover | Denville Scientific | D1180 |
| Harleco Alcohol 100% | EMD Millipore | 65347 |
| ENZO IVT Kit | ENZO | ENZ-42655-10 |
| Lyticase: one bottle | VWR | IC19012310 |
| Water, Cell Culture grade | EMD Millipore | 4.86505 |
| Yeast culture: | ATCC | 18824 |
| YPD broth powder | EMD Millipore | 4.8504 |
| D(+) Glucose, Anhydrous | EMD Millipore | 346351 |
| Sorbitol | EMD Millipore | 56755 |
| EDTA | EMD Millipore | 4005 |
| SDS solution, 20% | EMD Millipore | 7990-OP |
| Pellet Paint | EMD Millipore | 69049 |
| PCI RNase DNase free (7 aliquots): | Fisher | AC32711-500 |
| 7.5M NH4OAc | Fisher | ICN1987 5980 |
| Fragmentation Buffer (200 mM Tris-Acetate, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA) | ||
| Trizma Base | Fiaher | 50-899-90034 |
| KOAc | Fisher | NC9757725 |
| MgOA | Fisher | NC9681042 |
| Loading Dye | Invitrogen | 10482055 |
| PCR Markers | EMD Millipore | 69278-3 |
| Phase Lock Gels | Fisher | FP2302820 |
| One-Cycle cDNA Kit | Invitrogen | A10752-030 |
| Includes; | ||
| E. coli DNA Pol | ||
| dNTP’s | ||
| T4 DNA Pol. | ||
| T-7 oligod(T) | ||
| 0.5ml EDTA pH 8.0 | ||
| First Strand Buffer | ||
| E. Coli RNaseH | ||
| Second Strand Buffer | ||
| E. Coli DNA ligase | ||
| SuperScript II | ||
| DTT | ||
References
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., Kao, C. M., Carmel-Harel, O., Eisen, M. B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P. O. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 11, 4241-4257 (2000).
- D’Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
- Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis. J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).
- Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).
- Vermont Genetics Network. . Microarray Outreach. , (2008).
- . . Affymetrix GeneChip Expression Analysis: Technical Manual. , (2004).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Dennis, G., Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery. Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).
Citer Cet Article
Tighe, S., Hunter, T., Reed, P., Murray, J. Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (50), e2585, doi:10.3791/2585 (2011).