Microarray Analys för Saccharomyces cerevisiae</em

Summary

I detta protokoll genuttryck i jäst (<em> Saccharomyces cerevisiae</em>) Ändras efter exponering för oxidativ stress genom tillsats av väteperoxid (H₂ O₂), Ett oxidationsmedel.

Abstract

I detta protokoll är genuttryck i jäst (Saccharomyces cerevisiae) ändras efter exponering för oxidativ stress genom tillsats av väteperoxid (H ₂ O _2), ett oxidationsmedel. I experimentet är jäst odlas för 48 timmar i 1/2X YPD buljong innehåller 3X glukos. Kulturen är uppdelat i en kontroll och behandlade gruppen. Experimentet kulturen behandlas med 0,5 mm H ₂ O ₂ snodda saltlösning (HBSS) i 1 timme. Kontrollen kulturen behandlas med HBSS bara. Total RNA extraheras från båda kulturerna och omvandlas till en biotin-märkt Crna produkt genom en flerstegsprocess. Den slutliga syntesen produkten tas tillbaka till UVM Microarray Core Facility och hybridiseras till Affymetrix jästen GeneChips. Den resulterande genexpression uppgifter laddas upp i bioinformatik dataanalys programvara.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Isolera Totalt RNA från<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Hjälp Enzymatisk Lysis</p><ol><li> Förbered en RNase-fri arbete zon med RNas ZAP (Ambion).</li><li> Bered en färsk arbetar lyticase reagens genom att tillsätta 1 ml RNase-fritt vatten direkt till lyticase flaskan att göra en slutlig brukslösning av 10 U / ul. Vortex väl och vänd flera gånger för att försäkra fullständig blandning. Denna 10 enheter / l lösning är stabil i 12 timmar.</li><li> Bered en färsk DNas Jag lösning med Qiagen DNas kit och förvara på is.</li><li> Etikett ett 1,7 ml mikrocentrifugrör med din identifikation information. Överför 1,5 ml av lämpliga jästkultur i röret.</li><li> Centrifugera röret vid 5000 xg (ca 3 / 4 full hastighet) i 2 minuter i rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten (utan att störa pellets) med en mikropipett och kassera supernatanten.<strong>**** Upprepa steg 4 om pellets storlek är för liten eller om det anges av instruktör .****</strong</li><li> Lägg till 1000 l DEPC vatten till pellets, virvel, och centrifugera vid 5000 xg i 2 minuter. Kassera supernatanten. Ta bort så mycket av vätskan som möjligt från jästen pelleten.</li><li> Lägg till följande i jästen pellets och vortexa att blanda.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> SGbuffer</td><td> 10 l</td></tr><tr><td> Lyticasesolution (10u/μl)</td><td> 30 l</td></tr></tbody></table</li><li> Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.</li><li> Vagga försiktigt röret var 10 minut för att generera spheroplasts. Spheroplasts måste hanteras försiktigt. Undersök jäst under mikroskop för att observera hela spheroplasting. Samtidigt undersöker jästen på objektglas, tillsätt en liten mängd 0,1% SDS att orsaka jästen att svälla och bilda perfekt sfärer (även för blivande celler). Detta indikerar att cellväggarna har smält.</li><li> Lägg till 350 l b-RLT buffert till röret och vortexa<strong> Kraftigt</strong> I 1 minut. Se till att din tuben väl är utjämnat genom att hålla locket stängt medan vortexa. Detta förfarande kommer Lysera de spheroplasts.</li><li> Lägg till 250 l 100% etanol till röret och kort virvel. En fällning kan bildas efter tillsats av etanol, men detta kommer inte att påverka insamlingen av RNA.</li><li<strong> Insamling av RNA:</strong> Etikett en RNeasy snurra kolonn med identifiering informationand noggrant överföra alla av lösningen från steg 10 till snurra kolonnen med hjälp av en mikropipett. Var noga med att inte vidröra kvarts membranet med pipettspetsen. Stäng röret och centrifugera i 15 sekunder i full fart. RNA i provet kommer att ansluta sig till kvarts membranet i spinn kolumnen.</li><li> Ta bort snurra kolumnen från provröret. Pipettera de passerar vätskan (vätskan i provröret) tillbaka till spin kolonnen och centrifugera igen. Kassera provröret (med flödet genom vätska) och placera snurra kolumn till en ny 2 ml provröret.</li><li> Lägg till 350 l RW1 buffert för att snurra kolumnen. Denna lösning används för att tvätta RNA och ta bort salter och lösta cellulära skräp. Stäng röret och centrifugera i 15 sekunder i full fart.</li><li<strong> Smälta DNA:</strong> Ta bort snurra kolumn från centrifugen, öppna röret locket och tillsätt 80 ìl av DNas jag lösning på mitten av spin kolumnen membranet. Detta steg kommer smälta alla gDNA i provet. Stäng kolumnen locket och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.</li><li> Överför snurra kolumnen till ett nytt 2 ml provröret.</li><li<strong> Rengöring och tvätt av RNA:</strong> Lägg till 350 l RW1 buffert för att snurra kolonnen och centrifugera vid full fart i 15 sekunder.</li><li> Avvisa insamling röret och placera snurra kolumn till en ny 2 ml provröret.</li><li> Lägg till 500 l RPE buffert till spin kolumnen att tvätta RNA på kiseldioxid membranet. Stäng röret och centrifugera i 15 sekunder i full fart<em>.</em</li><li> Avvisa insamling röret och placera snurra kolumn till en ny 2 ml provröret.</li><li> Tvätta kvarts membranet igen med ytterligare 500 l RPE buffert för att snurra kolumnen. Stäng röret och centrifugera i 15 sekunder i full fart.</li><li> Placera snurra kolumn i ett nytt 2 ml provrör och centrifugera i mikrocentrifug i full hastighet under 1 minut för att se eventuella kvarstående vätska tas bort från kiseldioxid membranet.</li><li<strong> Återställa RNA:</strong> Överför RNeasy snurra kolumnen till ett nytt 1,7 ml mikrocentrifugrör som har märkt med ditt prov information. Observera att locket på den nya tuben kommer att lämnas öppen för de kommande stegen.</li><li> Försiktigt Pipettera 30 l RNase-fritt vatten<strong> Direkt på mitten</strong> Av kiseldioxid membranet.<strong> Rör inte kiseldioxid membranet med pipettspetsen (se diagram)</strong>. Titta noga när du utför detta steg. Använd båda händerna för att styra pipett. Se till att vattnet är jämnt fördelad på membranet.</li><li> Inkubera snurra kolumnen i rumstemperatur i 1 minut. Centrifugera i full fart i 30 sekunder.</li><li> Försiktigt överföra 30 l som återfinns i 1,7 ml tub tillbaka till mitten av kiseldioxid membran av samma spin kolumn som i steg 22 ovan. Placera kolonnen tillbaka i samma 1,7 ml provrör och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur. Centrifugera i 1 minut vid full hastighet. Denna dubbla eluering försäkrar att den maximala mängd RNA återvinns från membranet.</li><li> Märk två nya 1,7 ml mikrocentrifugrör med identifieringsuppgifter och överföra alla av det återvunna RNA provet till ett av dessa rör.</li><li> Överför 4 l av detta prov till de andra märkta röret. Detta prov kommer att transporteras tillbaka till UVM för Nanodrop kvantifiering och RNA kvalitativ bedömning (Detta är för att validera RNA kvantitativ och kvalitativ analys utförs på plats hos medverkande institut).</li><li> Lägg alla prover på is.</li><li<strong> RNA Kvantifiering:</strong> Använda Eppendorf Biophotometer, mät absorbansen hos RNA prov på en spektrometer vid 1 till 50 utspädning (1μl prov + 49μl H₂ O).</li><li> Utvärdera RNA kvalitet med hjälp av E-Gel (Invitrogen) 1,2% prefabricerade agarosgel för elektrofores.</li><li<strong> RNA kvalitativa analysen:</strong> Konfigurera e-gelelektrofores apparater. Pre-Kör gelen i 2 minuter enligt tillverkarens förfarande. Efter pre-run, ta bort gelen kam och tillsätt 14 l vatten till varje brunn följt av 1μl av varje prov i varje brunn. Blanda väl genom att pipettera upp och ned. Använd en lämplig stege storlek DNA i en brunn för storlek jämförelse senare (BioLine Lätt Ladder jag storlek standard eller Novagen PCR markör). Spela in vilket prov i varje körfält. Kör gelen i 20 minuter.</li><li> Ta ett foto av gelen.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Första Strand cDNA syntes</p><ol><li> Etikett en 0,5 ml PCR-rör med din legitimation information. Av koncentrationen av RNA bestämmas från ovanstående experiment, beräkna volymen av provet för att få 3,0 ug. Överför detta belopp till röret. Lägg tillräckligt RNas-fritt vatten för att få volymen till 11,0 ul.</li><li> Lägg till 1,0 l T7 oligo (DT)₂₄ Reagens till röret. Se till att ägna särskild uppmärksamhet åt pipettspetsen volymen under detta steg för att säkerställa att alla reagens överfördes. Vortex röret och centrifugera i full hastighet i 5 sekunder. Placera röret i en termocykler inställd på 70 ° C i 10 minuter.</li><li> Medan 70 ° C inkubering pågår, förbereda det första mix delen mästare i ett nytt rör. Var noga med att lägga till följande reagenser<strong> I ordning,</strong> Vortex och centrifugera vid full fart i 5 andra och placera röret på is.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> Första programområdet Master Mix:</strong</td></tr><tr><td> FirstStrandBuffer5X</td><td> 4 l</td></tr><tr><td> 0.1MDTT</td><td> 2 l</td></tr><tr><td> 10mMdNTP</td><td> 1 l</td></tr><tr><td> SuperscriptII</td><td> 1 l</td></tr></tbody></table<br> Använd en P2 mikropipett för att mäta volymer av 2 l eller mindre.</li><li> Efter 70 ° C inkubering i steg 2 är klar, tillsätt 8 ìl av den första delen Master Mix i steg 3 till röret och inkubera i en termocykler vid 42 ° C i 60 minuter. När första delen syntes inkubation är klar, placera röret på is. Under denna inkubation, förbereda den andra mixen delen mästare.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Andra programområdet cDNA syntes</p><ol><li> Gör följande andra mixen delen mästare i ett nytt rör. Håll det på is. Vortex och centrifugera alla reagenser innan användning. Tillsätt reagens i angiven ordning.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> Andra programområdet Master Mix</strong</td></tr><tr><td> DEPC Vatten</td><td> 91 ul</td></tr><tr><td> 5X Andra programområdet buffert</td><td> 30 ul</td></tr><tr><td> DNTPs (10mm)</td><td> 3 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> DNA-ligas (10U/ul)</td><td> 1 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> DNA-polymeras I (10U/ul)</td><td> 4 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> RNas H (2U/ul)</td><td> 1 ul</td></tr></tbody></table</li><li> Vortex röret och centrifugera i 5 sekunder i full fart.</li><li> När 42 ° C inkubering är klar, överföra alla 130 ìl av andra delen Master Mix till provröret som innehåller RNA och första reagenser strand. Virvel och centrifugera i 5 sekunder vid rumstemperatur. Inkubera röret i 2 timmar vid 16 ° C i en termocykler.</li><li> I slutet av 2 timmars inkubation och medan provet är fortfarande på 16 ° C, tillsätt 2μl T4 reagens DNA-polymeras till röret. Kortfattat virvel och centrifugera röret och inkubera vid 16 ° C i högst 5 extra minuter. Inkuberar längre än fem minuter kan försämra kvaliteten på cDNA grund av 3'to 5'exonuclease aktivitet T4 polymeras.</li><li> I slutet av de 5 minuters inkubation, tillsätt 10 l 0,5 M EDTA att stoppa T4 reaktionen DNA-polymeras. Förvara röret vid -20 ° C.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Utlösande det cDNA</p><ol><li> Centrifugera en fas tub Lock-Gel i full hastighet i en minut för att försäkra gelen är i botten av röret.<strong> INTE VORTEX Phase Lock RÖR</strong>.</li><li> Lägg till 162 ìl av<strong> Bottenskikt</strong> Från pH 8,0-Tris buffrad fenol / kloroform / Isoamyl Alkohol (PCI) till innehållet i den andra delen cDNA syntes reaktionsrör och vortexa i 5 sekunder för att blanda innehållet (Den totala volymen av cDNA syntes steget från ovanstående experiment är 162 ul. PCI steg kräver lika stora volymer vatten och organiska blandningar).</li><li> Överför alla cDNA-PCI blandningen till låsenhet gelen rör med hjälp av en mikropipett.<strong> INTE VORTEX</strong> Fas låset gelen rör.</li><li> Centrifugera vid full hastighet i 2 minuter.</li><li> Etikett en ny 1,7 tub ml mikrocentrifug. Använd en mikropipett för att överföra det översta lagret från fasen låset gelen röret till den nyligen märkt 1,7 ml rör. Försök att samla in så mycket av lagret som möjligt.</li><li> Lägg till följande i 1,7 ml mikrocentrifugrör och skaka.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> Etanol (100%)</td><td> 405 ul</td></tr><tr><td> NH₄ Oac</td><td> 80 ul</td></tr><tr><td> Pellet Paint</td><td> 1 ul</td></tr></tbody></table</li><li> Placera röret i centrifugen med gångjärn på röret utåt och centrifugera vid full fart i 20 minuter i rumstemperatur.</li><li> Försiktigt bort röret från centrifugen försiktigt så att inte störa cDNA pelleten. Den pellets ska vara rosa och ungefär storleken av en nypa salt och på sidan av röret under gångjärnet. Placera på is och omedelbart gå vidare till nästa steg.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Rengöring av cDNA Pellet</p><ol><li> Med hjälp av en P1000 mikropipett, försiktigt ta bort alla supernatanten från röret. Var noga med att inte störa pelleten. Kom ihåg att pellets är ditt prov!</li><li> Lägg 500μl kall 80% etanol (förvaras i -20^° C frys) till röret. Försiktigt locket på röret och vänd den sakta flera gånger. Titta på dina pellets mycket noga. Om pellets lossnar, placera röret tillbaka i rack och låt pellets sjunker till botten. Alternativt kan du centrifugera röret i full fart i 15 sekunder för att få pellets tillbaka ner till botten av röret.</li><li> Med hjälp av en P1000 mikropipett, försiktigt bort etanolen är mycket noga med att inte störa pelleten. Tips röret för att avlägsna så mycket vätska som möjligt.</li><li> Upprepa steg 2 och 3 med en ny portion av 80% etanol.</li><li> Slutligen, ta bort alla etanol möjligt genom en P1000 mikropipett. Centrifugera röret i full hastighet i 5 sekunder och med hjälp av en P20 mikropipett, ta bort de sista mikroliter av etanol. Målet är att ta bort så mycket etanol som möjligt utan att störa pelleten.</li><li> Placera de öppna röret i ett rack eller torkning box för 10-20 minuter för att förånga resterande etanol. Den torkade pellets är lätt förlorad när den är torr. Becareful att hantera röret försiktigt. När du är klar, stäng locket. Visualisera de torkade pellets för att bekräfta den finns i röret.</li><li> Återsuspendera pelleten i 22 ìl RNase-fria vatten och placera röret på is.</li></ol><p class="jove_title"> 6. InVitroTranscription (IVT)</p><ol><li> Enzo bioarray innehåller alla reagenser som behövs för att förbereda biotin märkt Crna från cDNA.<br /> En mästare mixfor hela klassen kommer att vara förberedda som follows.The instruktör kommer att förbereda denna mix eller utse någon från klassen. Detta måste göras i en RNase-fri zon.<br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Amt / prov</td><td> # Prover</td><td> Total</td></tr><tr><td> Reagens 1 [10x Reaktion buffert]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagens 2 [10x Biotinnucleotides]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagens 3 [10x DTT]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagens 4 [10x RNas Inhibitor]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagens 5 [20x T7 RNA-polymeras]</td><td> 2μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Total volym</td><td> 18 l</td><td></td><td></td></tr></tbody></table<br><strong> OBS!</strong> Förbered tillräckligt Master Mix för det antal prover plus ett. Detta kommer att försäkra tillräckligt för pipettering ändamål.</li><li> Etikett en 0,5 ml PCR-rör. Kombinera följande i röret och pipettera upp och ned flera gånger för att blanda. Snurra i en centrifug i full hastighet i 5 sekunder för att få alla reagenser till botten av röret.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> CDNA blandning</td><td> 22μl</td></tr><tr><td> Enzomastermix [fromabove]</td><td> 18μl</td></tr><tr><td> TotalVolume</td><td> 40μl</td></tr></tbody></table</li><li> Inkubera röret vid 37 ° C for16 timmar i termocykler. När reaktionen är klar, förvara provet vid -20 ° C</li></ol><p class="jove_title"> 7. Rengöring av biotinylerad Crna</p><ol><li> Överför hela Crna provet till ett nytt 1,7 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 60 ìl RNase-fritt vatten och 350 l RLT buffert och virvel i 5 sekunder.</li><li> Lägg till 250 l 100% etanol och skaka igen.</li><li> Etikett en RNeasy spin kolumn och överföra hela Crna provet till kolonnen. Var noga med att inte röra toppen av pipett till kisel membran. Stäng locket och centrifugera i 15 sekunder i full fart.</li><li> Ta bort snurra kolumnen från provröret. Pipettera de passerar vätskan (vätskan i provröret) tillbaka till spin kolonnen och centrifugera igen i 15 sekunder.</li><li> Placera snurra kolumn till en ny 2 ml provröret och pipettera 500 l av RPE buffert på spin kolumnen. Stäng röret och centrifugera i 15 sekunder i full fart. Kasta provrör och passera vätskan. Placera snurra kolumn till en ny 2 ml provröret.</li><li> Lägg till ytterligare 500 l RPE buffert för att snurra kolumnen.</li><li> Överför snurra kolumn till en ny kollektion rör och utföra en kolumn "torkning" spin i full hastighet i 2 minuter.</li><li> Etikett en ny 1,7 tub ml mikrocentrifug med din identifikation information. Överför snurra kolumnen till detta rör.</li><li> Pipettera 30 l RNase-fritt vatten på mitten RNeasy kvarts membranet och inkubera vid rumstemperatur i 1 minut. Tillslut röret och centrifugera i 1 minut vid full hastighet.</li><li> Försiktigt överföra 30 l som återfinns i 1,7 ml tub tillbaka till mitten av RNeasy kiseldioxid membran av samma spinn kolumn. Placera kolonnen tillbaka till samma 1,7 ml provrör och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur. Centrifugera i 1 minut vid full hastighet. Denna dubbla eluering försäkrar att den maximala mängden Crna återvinns från membranet.</li><li> Överför ren biotin-märkt Crna till ett nytt 1,7 ml centrifugrör och etikett på lämpligt sätt.</li><li> Bestäm Crna koncentration med samma procedur som beskrivs ovan under RNA isolering förfarande. Spela koncentrationen och 260/280 förhållandet.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Splittrar Crna för Target förberedelse</p><ol><li> Etikett en 0,5 ml PCR-rör med din legitimation information. Överföring 5 ug av motsvarande mängd Crna till röret. Lägg tillräckligt RNas-fria vatten att den totala volymen till 16,0 ul, och lägg sedan till 4,0 l av 5X fragmentering buffert till röret. Den totala volymen i slangen bör vara 20,0 ul.</li><li> Vortex röret och centrifugera i 10 sekunder. Inkubera röret vid 94 ° C i 30 minuter i en termocykler. Sätt på isen efter inkubation.</li></ol><p class="jove_title"> 9. Bedöma Den fragmenterade och Unfragmented Crna med agarosgel</p><ol><li> Konfigurera e-gelelektrofores apparat med hjälp av en 1,2% prefabricerade agarosgel. Pre-Kör gelen i 2 minuter efter tillverkning rekommendation</li><li> Lägg till 14 l vatten till varje brunn på E-gel.</li><li> Lägg 2μl av varje prov i varje brunn och pipettera upp och ner för att blanda väl. Analysera både splittrat och unfragmented Crna i varje prov. Det är bäst att ladda prover (fragmenterad och unfragmented) i angränsande körfält. Registrera identiteten på varje prov i varje körfält.</li><li> Lägg till 4 ìl av en DNA-stege (BioLine Lätt Ladder jag storlek standard eller Novagen PCR markör) till ett körfält i gelen</li><li> Kör gelen i 20 minuter.</li><li> Visualisera E-gel på en transilluminator. Ta en gel bild.</li></ol><p class="jove_title"> 10. Hybridisering att jästen 2,0 GeneChip</p><p class="jove_step"> Representativa resultat:</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Figur 1.</strong> En skannad Affymetrix Jäst GeneChip Bild (Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Figure2.</strong> 2D punktdiagram av alla genetiska avskrifter (~ 6700 gener), att jämföra en kontrollgrupp och behandlas uppgifter jäst. Varje punkt representerar en enda gen. Gener färgade i lila visar gener som differentiellt uttrycks medan gener färgade i rött är det inte. Beskrivningar för differentiellt uttryckta gener är märkta i motsvarande legenden och de flesta är involverade i kontrollen av cellcykeln i detta exempel. (Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig3.jpg" alt="Figure 3" ><strong> Figur 3.</strong> Det här flödesschemat illustrerar differentiellt uttryckta gener i en drabbad biologisk väg. Generna indikeras med en röd stjärna indikerar ned-reglerade gener i meiotiska väg. (Databasen för Annotation, visualisering och Integrerad Discovery (David)</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig4.jpg" alt="Figure 4" ><strong> Figur 4.</strong> Representativa resultat av en vulkan Plot. Kontroll och behandlade prover jämfördes med ett p-värde avskurna på 0,05 och en 1,5-faldig uttryck förändras avskuren. Denna tomt var genereras med hjälp Geospiza är Genesifter mjukvara vänligt donerade till eleverna i undervisningssyfte.</p>

Discussion

<p class="jove_step"> Program och betydelse.</p><p class="jove_content"> The Vermont genetik Network uppsökande program, vid University of Vermont, bedriver grundutbildning uppsökande verksamhet till åtta högskolor partner studentexamen i hela staten. Målet för VGN Outreach Core är att utsätta studenter i delstaten Vermont till state-of-the-art vetenskaplig teknik och resurser med hjälp av praktiska erfarenheter. Den microarray modul beskrivs utvecklades under 2003 och därefter uppgraderas. Det har erbjudits som en mini-kurs eller integreras i befintliga laboratorium läroplanen på de deltagande institutionerna.</p><p class="jove_content"> Detta projekt, mellan kärnor forskningsuniversitet och grundutbildning högskolor, främjar samarbeten inom utbildning och forskning. Microarray uppsökande i hela staten har förbättrat läroplan och skapat forskning och möjligheter till nätverkande för centrala anläggningar, lärare och studenter.</p><p class="jove_content"> Som grundutbildning fakultet anta programmet de uppmuntras att designa unika experiment förutsatt att det finns lämpliga Affymetrix GeneChips och anteckningar finns. All information för denna modul inklusive laboratoriet handbok, referenser och PowerPoint-presentationer finns tillgängliga online (Vermont Genetics Network, 2008).</p><p class="jove_step"> Kritiska steg:</p><p class="jove_content"<em> Spheroplasting:</em> Det är viktigt att observera framgångsrika spheroplasting under mikroskop. Användningen av SDS är mycket fördelaktigt eftersom det orsakar jästen svullnad resulterar i spheroids. Det är viktigt att observera att den spirande cellerna bildar spheroids också. Om partiell spheroplasting observeras, är en förlängd behandling med lyticase rekommenderas.</p><p class="jove_content"<em> Pellet rengöring:</em> Under nederbörd reaktion och påföljande etanol tvätt är det mycket lätt att förlora det cDNA pelleten. Extrem försiktighet och noggrann uppmärksamhet på pellets är absolut nödvändigt.</p><p class="jove_content"<em> Ansökan vattnet till mitten av membranet:</em> Under RNA elueringen steget från membranet, är det viktigt att "spruta" den 30 l vatten direkt till mitten av kiseldioxid membranet. Om detta inte sker, kan kolumnen centrifugeras och den resulterande elutant kan åter tillämpas på kisel membranet igen. Detta kan upprepas så många gånger som behövs.</p><p class="jove_step"> Ändringar och spelarbyten Produkt:</p><ol><li> Alternativ RNA sanering kolumner kan ersättas. Exempel är USB-prep-lätthet och Invitrogen Ren Link RNA-kit, och Omega RNA saneringen kit för att nämna några.</li><li> Schizosaccharomyces pombe är en valfri jäst. Den Affymetrix GeneChip innehåller både genomen på samma chip</li><li> Olika behandlingar och tider kan användas. Detta kan inkludera läkemedelsbehandlingar, behandlingar temperatur, antioxidanter, får etc. Behandling gånger också justeras.</li><li> DNas behandling kan inte krävas eftersom de metoder som beskrivs sysselsätter användningen av en Oligo (DT) primer.</li><li> Det är inte skyldig att utföra en dubbel eluering av RNA från kolumn med samma 30 l delmängd. När är nästan alltid tillräckligt. Det föreslås att försäkra att en fullständig återhämtning erhålls. Dessutom kan det vatten som används för att eluera RNA från kolumnen värmas till 65 ° C för att ytterligare öka förmågan att återhämta RNA från kvarts kolumn.</li><li> Många metoder finns tillgängliga för att kvantifiera RNA. Den Eppendorf och Nanodrop har bara valts ut för sin användarvänlighet och testade noggrannhet.</li><li> Agarosgelelektrofores många utföras med hjälp av vanliga laboratorieutrustning. E-Gel är inte nödvändigt men är önskvärt eftersom det är RNas gratis och kräver inte gelen stelna väntetid.</li><li> Beställningsinformation för varor har levererats. Däremot kan många allmänna reagenser beställas från flera leverantörer.</li><li> En cykel cDNA reagenser kan köpas separat om det är mer kostnadseffektivt.</li><li> Det finns andra mål prep metoder men vi känner att det här ger mer pedagogiska möjligheter för studenten.</li></ol>

Materials

General Laboratory Equipment	Company	Product number
Spetrophotometer
Thermocyler
Microcentrifuge
Vortex
Stir Plates (2)
P-10s pipettors
P-20’s pipettors:
P-200’s pipettors:
P-1000’s pipettors:
Camera and transilluminator
Supplies – recommended
E-Gel Apparatus	Invitrogen	G6000-08
E-Gels	Invitrogen	G6018-02
Axygen 1.7 ml. Clear	Krackler	383-MCT175C
Axygen 0.5 ml clear tubes	Krackler	383-MCT060C
Axygen 2ml capture tubes	Krackler	383-MCT200NC
boxes of P-10 ART tips:	CLP	BT10XL
Boxes of P-100 ART tips:	CLP	BT200
Boxes of P-20 ART Tips:	CLP	BT20
Boxes of P-1000 ART Tips:	CLP	BT1000
Yeast Chips
General Laboratory Supplies
25 ml sterile disposable pipets-
5ml sterile disposable pipets-
Microfuge tube racks
KimWipes:
Lab Coats
Stir Bars
Culture flasks
Innoculating loops
Sharpies
Gloves
Autoclave tape
Stirrer bars
Reagents
30% Hydrogen Peroxide	EMD Millipore	386790
HBSS without Ca, Mg, or dye	Sigma-Aldrich	H6648-100ml
Qiagen Rneasy Mini Kit:	Qiagen	74104
Qiagen DNase Kit:	Qiagen	79254
Rnase Remover	Denville Scientific	D1180
Harleco Alcohol 100%	EMD Millipore	65347
ENZO IVT Kit	ENZO	ENZ-42655-10
Lyticase: one bottle	VWR	IC19012310
Water, Cell Culture grade	EMD Millipore	4.86505
Yeast culture:	ATCC	18824
YPD broth powder	EMD Millipore	4.8504
D(+) Glucose, Anhydrous	EMD Millipore	346351
Sorbitol	EMD Millipore	56755
EDTA	EMD Millipore	4005
SDS solution, 20%	EMD Millipore	7990-OP
Pellet Paint	EMD Millipore	69049
PCI RNase DNase free (7 aliquots):	Fisher	AC32711-500
7.5M NH4OAc	Fisher	ICN1987 5980
Fragmentation Buffer (200 mM Tris-Acetate, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)
Trizma Base	Fiaher	50-899-90034
KOAc	Fisher	NC9757725
MgOA	Fisher	NC9681042
Loading Dye	Invitrogen	10482055
PCR Markers	EMD Millipore	69278-3
Phase Lock Gels	Fisher	FP2302820
One-Cycle cDNA Kit	Invitrogen	A10752-030
Includes;
E. coli DNA Pol
dNTP’s
T4 DNA Pol.
T-7 oligod(T)
0.5ml EDTA pH 8.0
First Strand Buffer
E. Coli RNaseH
Second Strand Buffer
E. Coli DNA ligase
SuperScript II
DTT