ध्यान केंद्रित आयन बीम मिलिंग और मस्तिष्क के ऊतकों के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे राल एम्बेडेड मस्तिष्क के ऊतकों और तैयार किया जा सकता है ध्यान केंद्रित आयन बीम में तीन आयामों में imaged, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप.

Abstract

इस प्रोटोकॉल का वर्णन है जैविक कैसे नमूने, मस्तिष्क के ऊतकों की तरह, ध्यान केंद्रित आयन इलेक्ट्रॉन / खुर्दबीन स्कैनिंग बीम (FIB / SEM) का उपयोग कर तीन आयामों में imaged किया जा सकता है. नमूने aldehydes, भारी धातु आज़मियम tetroxide और uranyl एसीटेट का उपयोग दाग के साथ तय कर रहे हैं. वे तो शराब के साथ निर्जलित हैं और राल, जो कठोर तो है साथ घुसपैठ की. एक रोशनी खुर्दबीन और कांच के चाकू के साथ ultramicrotome का उपयोग, एक छोटे से क्षेत्र की सतह के करीब ब्याज युक्त ब्लॉक किया जाता है. ब्लॉक तो FIB / SEM के अंदर रखा है, और आयन बीम को मोटे तौर पर एक ऊर्ध्वाधर चेहरा मिल ब्लॉक के एक पक्ष के साथ करने के लिए इस्तेमाल किया, इस क्षेत्र के लिए करीब है. Backscattered इलेक्ट्रॉनों का उपयोग अंतर्निहित संरचनाओं छवि के लिए, एक छोटे चेहरा तो एक बेहतर आयन बीम के साथ milled है और सतह के और अधिक बारीकी से से छानबीन करने के लिए चेहरे की सटीक क्षेत्र imaged और milled निर्धारित है. माइक्रोस्कोप के मापदंडों तो सेट कर रहे हैं ताकि चेहरा बार – बार और milled है imaged इतना है कि सीरियल छवियों ब्लॉक के एक मात्रा के माध्यम से एकत्र कर रहे हैं. छवि ढेर आम तौर पर छोटे प्रत्येक दिशा में एक 4 एनएम के रूप में आयामों के साथ isotropic voxels शामिल होंगे. किसी भी इमेजिंग विमान में यह छवि गुणवत्ता छवि ढेर के भीतर किसी भी कोण को देखने में सेल ultrastructure का विश्लेषण करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है.

Protocol

1. नमूना निर्धारण और राल एम्बेडिंग ताजा ऊतक और कोशिकाओं के नमूने 2% paraformaldehyde में कम से कम 2 घंटे के लिए तय कर रहे हैं, और 7.4 का पीएच 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 2.5% glutaraldehyde. नमूने का आकार 0.150 मिमी मोटाई में से अधिक नहीं करने के लिए पर्याप्त पैठ या लगानेवाला की अनुमति चाहिए, और तय करने में 12 घंटे से अधिक समय के लिए नहीं छोड़ा जाना चाहिए. 20ml कांच जगमगाहट शीशियों में नमूने प्लेस और उन्हें तीन बार, 0.1M cacodylate बफर में 5 मिनट प्रत्येक, कुल्ला. 1.5% (w / v) पोटेशियम ferrocyanide और 1% (w / v) 30 मिनट के लिए 0.1 एम cacodylate बफर (एम 0.1, 7.4 पीएच) में आज़मियम tetroxide के साथ दाग. 0.1M cacodylate बफर में 30 मिनट के लिए 1.0% (w / v) आज़मियम tetroxide के साथ दाग. 3 मिनट के लिए दोहरा आसुत जल के साथ एक बार कुल्ला. 1% (w / v) दोहरा आसुत जल में 30 मिनट के लिए uranyl एसीटेट के साथ दाग. दोहरा आसुत जल में 5 मिनट के लिए वर्गों कुल्ला, और तब वर्गीकृत शराब श्रृंखला, 2 मिनट प्रत्येक परिवर्तन (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%) में निर्जलीकरण. 70%, 90%, 95%, और तब 100%: Durcupan इथेनॉल के साथ मिश्रित राल, 30 मिनट प्रत्येक परिवर्तन, इथेनॉल में 50% Durcupan पर शुरू की बढ़ती सांद्रता में एम्बेड करें, तो द्वारा पीछा. ताजा Durcupan के साथ बदलें और 4 घंटे के लिए धीरे आंदोलन. प्लेस वर्गों, लकड़ी कॉकटेल चिपक का उपयोग, कांच सूक्ष्मदर्शी पर मोल्ड अलग एजेंट के साथ लेपित है, और 65 में जगह स्लाइड ° 24 घंटे के लिए ओवन सी. 2. FIB / SEM के लिए नमूना तैयारी अलग राल परत, नमूने युक्त, दो गिलास खुर्दबीन स्लाइड के बीच से और अच्छी तरह से धोने के लिए किसी भी एजेंट को अलग मोल्ड हटाने. कम बिजली उद्देश्यों के साथ प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, या प्रेषित रोशनी के साथ खुर्दबीन विदारक, राल का टुकड़ा के भीतर ब्याज के क्षेत्र की पहचान है. एक छोटी सी (3 मिमी x 3 मिमी) ब्याज की एक रेजर ब्लेड का उपयोग क्षेत्र के आसपास वर्ग कट और एक्रिलिक गोंद के साथ रिक्त राल ब्लॉक (चित्रा 1) के शीर्ष करने के लिए यह छड़ी. कठोर गोंद के लिए 5 मिनट रुको, और फिर अगले कदम के साथ आगे बढ़ना. Ulramicrotome के धारक में ब्लॉक दबाना और संलग्न stereomicroscope का उपयोग करने के लिए, केवल सामग्री अवशेषों के एक छोटे पिरामिड तक एक धार के साथ ब्याज के क्षेत्र के आसपास ट्रिम कर दीजिए. इसके अलावा ब्लॉक ट्रिम, एक गिलास ultramicrotome में तय है, ताकि ब्याज के क्षेत्र ठीक सम्मान के साथ स्थित किया जा सकता है ब्लॉक की सतह (चित्रा 1) के आयाम चाकू का उपयोग कर. ब्लॉक के एक किनारे कट करने के लिए, ब्याज के क्षेत्र के करीब है, ताकि एक सीधा कदम नमूना के माध्यम से कट जाता है (चित्र 1 और 2). यह कदम इमेजिंग चेहरा (चित्रा 2) रूपों. Ultramicrotome और ब्लॉक के भीतर ब्याज के क्षेत्र की तस्वीर से ब्लॉक निकालें, एक संचारित प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर. शेष राल ठूंठ से छंटनी ब्लॉक दूर कट. यह एक जौहरी देखा का उपयोग करके किया जाता है और यह सुनिश्चित करता है कि केवल एक छोटी सी ब्लॉक FIB / SEM के अंदर रखा गया है. इस ब्लॉक की कुल ऊंचाई 5 मिमी से अधिक नहीं होना चाहिए. गोंद ब्लॉक कार्बन पेस्ट के साथ एक एल्यूमीनियम ठूंठ सुनिश्चित करना है कि imaged किया जा पक्ष बाह्यतम किनारे (चित्रा 1) पर है. गोंद के बाद सूख गया है, सोने की एक पतली परत (> 20 एनएम; Cressington निर्वात वाष्पीकरण प्रणाली) के साथ ब्लॉक कोट. 3. FIB / SEM में इमेजिंग एक कम बढ़ाई, और माध्यमिक इलेक्ट्रॉन इमेजिंग (5 केवी, 0.5 nAmp), पूरबी ब्लॉक इतना का उपयोग है कि ब्याज और ब्लॉक के पक्ष चुना क्षेत्र imaged किया जा ऑपरेटर का सामना करना पड़ रहा है (चित्र 2 ग, घ). ओरिएंट ब्लॉक ताकि चेहरे imaged किया जा मिलिंग किरण समानांतर निहित है. इसका मतलब यह होगा कि 54 इस चेहरे के लिए ° (चित्रा 2 ख) इलेक्ट्रॉन बीम पर उन्मुख है. 13 के एक आयन बीम वर्तमान का उपयोग करना – 30 केवी पर 27 nAmps imaged किया जा क्षेत्र के सामने से राल का एक संकीर्ण बैंड हटायें. Backscattered इमेजिंग मोड के लिए स्विच करने के लिए milled चेहरा है कि ब्याज के क्षेत्र overlies देखने के लिए. Milled और imaged (चित्रा 2) खंड पर सटीक क्षेत्र का पता लगाने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी संदर्भ (16 कदम पर लिया) छवि और milled चेहरे की छवि का उपयोग. कार्बन (या धातु) की एक सुरक्षात्मक परत (लगभग 1 माइक्रोन मोटी), माइक्रोस्कोप के गैस इंजेक्शन प्रणाली का उपयोग कर, ब्लॉक की सतह पर ब्याज के क्षेत्र (चित्रा 2) से ऊपर जमा. 700 picoAmps, पतले ब्लॉक के क्षेत्र के भीतर जो अंतिम छवियों लिया जाएगा मिल के एक वर्तमान का उपयोग. पूरी तरह से इस छवि चेहरा मिल जब तक कोई मिलिंग कलाकृतियों चेहरे पर देखा जा सकता है है मिलिंग किरण छोड़ो. चेहरे की एक पूरी मिल देखने के पूरे क्षेत्र भर में प्रत्येक बाद छवि में परिवर्तन देख द्वारा जाँच की है. अपर्याप्त मिलिंग भी सफेद धारियाँ या 'पर्दे' vertica दिखने के रूप में देखा जा सकता हैlly छवि में. फैलने किसी भी थर्मल परिवर्तन के लिए एक कम से कम 2 घंटे के लिए माइक्रोस्कोप छोड़ो. यह जोखिम है कि ब्लॉक चेहरा इमेजिंग के दौरान बहाव, misaligned छवियों में जिसके परिणामस्वरूप कम कर देता है. चेहरे serially इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप मापदंडों का चयन करें. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रॉन बीम एक वोल्टेज है कि केवल ब्लॉक चेहरे में सामग्री का एक बहुत उथले गहराई छवि के लिए काफी कम है. यह भी हटाया जा चेहरे का मोटाई की तुलना में बहुत shallower होना चाहिए. इमेजिंग के लिए विशिष्ट मानकों 1.2 के बीच voltages हैं – के बीच की पिक्सेल आकार के साथ 2.0 केवी 4 – 20 एनएम. पिक्सेल समय की जरूरत है ध्यान केन्द्रित करने के लिए 10 μsecs ताकि कुल चेहरा मिल और एक छवि अधिग्रहण समय 2 मिनट के नीचे रखा है (चित्रा 3) के आसपास रखा जाना. 4. सफलता के लिए रहस्य चरण 1) सुनिश्चित करें नमूने 150 माइक्रोन से अधिक गहरा नहीं कर रहे हैं . यह अलग सामग्री में दाग और राल की पर्याप्त पैठ सक्षम हो जाएगा. यह निर्धारण के तुरंत बाद एक vibratome साथ नमूने सेक्शनिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है . यह मोटाई मस्तिष्क के ऊतकों के लिए उपयुक्त है . अन्य ऊतकों करने के लिए पर्याप्त निर्धारण और धुंधला हो जाना सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण किया जा जरूरत है. चरण 3) नमूने स्वतंत्र रूप से समाधान भर में वितरित किया जाना चाहिए, और शीशी के एक भाग में नहीं clumped एक साथ, जबकि इस द्वितीयक लगानेवाला शुरू की है. इस नमूने की अधिकतम पैठ को सुनिश्चित करने और इस निर्धारण की प्रक्रिया के दौरान विकृत बनने नमूना कम हो जाएगा. यह शीशी के तुरंत बाद समाधान जोड़ा जाता है के भीतर धीरे घूमता नमूने द्वारा हासिल की है . 15 चरण) सुनिश्चित करें कि क्षेत्र के हित के तुरंत नीचे स्थित है (<30 microns) ब्लॉक की सतह. यह आयन बीम द्वारा छवि अधिग्रहण चरण के दौरान मिलिंग की राशि कम हो जाएगा. 22 चरण) आयन बीम के समय स्कैनिंग करने के लिए सुनिश्चित करें कि पूरे इमेजिंग चेहरा पूरी तरह से milled है adequte की जरूरत है. अपर्याप्त मिलिंग सफेद धारियाँ, या 'पर्दे' इमेजिंग चेहरा नीचे खड़ी दिखने के रूप में दिखाया जाएगा. चरण 26) अंतिम milled चेहरा imaged है कि चेहरे की तुलना में बड़ा होना चाहिए. इसका कारण यह है milled राल ब्लॉक और तत्काल आसपास के क्षेत्र में ब्लॉक की सतह पर redeposits से निकली है . यह redeposition देखने के इमेजिंग के क्षेत्र पर अतिक्रमण कर सकते हैं, और एक बहुत बड़े क्षेत्र की तुलना में imaged है मिलिंग के द्वारा बचा है. एक इमेजिंग खिड़की है कि 20 microns चौड़ी है, milled ब्लॉक चेहरे से अधिक 30 microns चौड़ी है . 29 चरण) यह महत्वपूर्ण है कि इलेक्ट्रॉन बीम मापदंडों ऐसी है कि छवि इलेक्ट्रॉनों द्वारा उत्पन्न होता है कि ब्लॉक सतह के केवल पहले कुछ नैनोमीटर से उभरने हैं . यह एक नीचे 2 केवी वोल्टेज कम करने और सुनिश्चित करना है कि बहुत दूर नहीं इलेक्ट्रॉनों घुसना द्वारा acheved. यह भी डिटेक्टर पर एक ग्रिड वोल्टेज का उपयोग केवल इतना है कि उच्चतम ऊर्जा के साथ अंतिम छवि के लिए इलेक्ट्रॉन योगदान करके मदद की है. आमतौर पर, 1.3 केवी का एक ग्रिड तनाव 1.5 केवी के एक इमेजिंग वोल्टेज के लिए प्रयोग किया जाता है . 5. प्रतिनिधि परिणाम: चित्रा 1 राल ब्लॉक तैयार.) राल एक वयस्क चूहे steromicroscope में देखी गयी मस्तिष्क के माध्यम से राज्याभिषेक खंड (80 मोटी microns) एम्बेडेड. छवि स्पष्ट रूप से अलग मस्तिष्क क्षेत्रों है कि खंड (ख) एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर से काटा जा सकता है दिखाता है. यहाँ, प्रांतस्था से 1 मिमी वर्ग हटा दिया है और (ग) एक रिक्त राल ब्लॉक करने के लिए अटक) राल ब्लॉक तो एक गिलास एक ultramicrotome में घुड़सवार चाकू के साथ छंटनी की है, और एक बार ब्लॉक करने के लिए केवल छोड़ कम हो गया है ब्याज की क्षेत्र (ई), एक कदम एम्बेडेड सामग्री के सामने की सतह के लिए सीधा कट जाता है च.) इस पूरे क्षेत्र छंटनी तो राल के बाकी हिस्सों से कट जाता है और एक एल्यूमीनियम धातु कोटिंग के लिए तैयार में ठूंठ और इमेजिंग पर घुड़सवार स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप. चित्रा 2 FIB / SEM इमेजिंग के लिए ब्लॉक चेहरे की तैयारी के लिए एक) और ख) इमेजिंग चेहरा (काले दो सिरों वाले तीर के साथ संकेत) बनाने के लिए milled है कि ब्लॉक और बढ़त के चित्र दिखाने के. आयन बीम (सफेद) की स्थिति समानांतर इमेजिंग चेहरा दिखाया है, और इलेक्ट्रॉन बीम (ग्रे) 54 ° आयन बीम चेहरे मार दिखाया गया है ग) इलेक्ट्रॉन बीम के साथ लिया ब्लॉक के एक दृश्य दिखाता है और माध्यमिक इलेक्ट्रॉनों के साथ imaged. ब्लॉक के इस पक्ष के साथ एक गहरा क्षेत्र (बिंदीदार सफेद बॉक्स के साथ संकेत) चेहरा है कि मोटे तौर पर किया गया milled किया गया है के एक हिस्से से पता चलता है (डबल सिर के साथ दिखाया गया हैएड काला तीर) अंतर्निहित नमूना प्रकट करने के लिए घ) एम्बेडेड ऊतक सकता है जब इस क्षेत्र केवल backscattered इलेक्ट्रॉनों का उपयोग imaged है देखा जाना चाहिए.. यहाँ, एम्बेडेड ऊतक अनुभाग की पूरी चौड़ाई एक डबल अध्यक्षता में सफेद तीर के साथ संकेत दिया है. ग में स्केल पट्टी) 100 microns है. चित्रा 3. इमेजिंग isotropic voxels के साथ मस्तिष्क के ऊतकों की एक मात्रा.) ब्लॉक चूहा मस्तिष्क के एक क्षेत्र के भीतर ultrastructure दिखा चेहरे के विपरीत backscattered छवि उलट है. सभी झिल्ली के रूप में अच्छी तरह के रूप में दिखाई बड़े macromolecular संरचनाओं ख) 1600 छवियों की कुल एनएम 5 रिक्ति isotropic. ग) यह स्टैक एक ही संकल्प के साथ किसी भी विमान में imaged किया जा सकता voxels के साथ एक छवि ढेर में जिसके परिणामस्वरूप में एकत्र किए गए थे. इस छवि को एकल synaptic कनेक्शन है कि xy विमान और yz विमान में imaged है दिखाता है.

Discussion

FIB / SEM की तकनीक बेहतर काम करता है जब ब्याज के क्षेत्र बहुत बड़ा नहीं है. एक imaged मात्रा के लिए ऊपरी सीमा आयन बीम और क्षेत्र पर निर्भर करता है कि यह कई घंटे से अधिक लगातार बार – बार मिल सकते हैं. अब तक यह करीब 60 x 60 microns के क्षेत्रों के साथ किया गया है, तथापि, इमेजिंग इस पूरे क्षेत्र को एक उपयुक्त छवि संकल्प के साथ संभव नहीं है, मुख्य रूप से इतनी बड़ी छवि एकत्र करने में समय कारक के कारण. एक उदाहरण के रूप में, एक पिक्सेल के साथ एक 4 kx 4 कश्मीर की छवि पर ध्यान केन्द्रित करना 10 microseconds के लिए समय 2 मिनट और 40 सेकंड के लिए अधिग्रहण ले, और 60 microns के दृश्य के एक क्षेत्र के लिए यह केवल 15 एनएम के एक पिक्सेल आकार देना होगा. आमतौर पर 4 और 10 एनएम / पिक्सेल के बीच, कोशिकाओं और ऊतकों के ultrastructure इमेजिंग के लिए, एक छोटे पिक्सेल आकार और अधिक उपयुक्त है. छवि 60 x 60 microns के एक क्षेत्र के लिए 10 घंटों में प्राप्त होगा, भले ही खुर्दबीन इस क्षमता थी. इन कारणों के लिए, माइक्रोस्कोप 10 x 10 x 10 microns, या पूरे कोशिकाओं के महत्वपूर्ण क्षेत्रों के क्रम में एक छवि संस्करणों के लिए एक आदर्श उपकरण है. यह आसानी से नमूने कर रहे हैं कि इस प्रक्रिया के साथ अच्छी तरह से विपरीत है पर एक 48 घंटे की अवधि के भीतर किया जा सकता है है.

अब तक प्रोटोकॉल मस्तिष्क के ऊतकों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सभ्य स्तनधारी coverslips के लिए पालन कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के साथ किया गया है मुख्य रूप से प्रयोग किया जाता है. हालांकि, निर्धारण और धुंधला हो जाना प्रक्रिया जैविक सामग्री के कई अन्य प्रकार के संयंत्र के लिए समान रूप से अच्छी तरह से विपरीत छवि के ढेर का उत्पादन सामग्री सहित, के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

इसलिए इस तकनीक का मुख्य लाभ isotropic voxels के साथ अपनी छवि मात्रा क्षमता है. इस प्रकार की छवि के ढेर के ढेर में किसी भी विमान में लिया छवियों का उपयोग 3 डी की मात्रा के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. इस के लाभ के लिए किसी भी दिशा से छवि श्रृंखला में और एक बड़ा छवि विस्तार (चित्रा 3) प्रदान छवि सुविधाओं के लिए पर्यवेक्षक की अनुमति है.

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue number
Cyanoacrylate glue
Dissecting microscope: Leica MZ8	Leica Microsystems, Germany
Durcupan resin	Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Switzerland
FIB/SEM microscope (Zeiss, NVision 40)
Glass histology slides	Menzel-Gläser, Germany	AA00008032E
Glass knife maker: Leica EM KMR2	Leica Microsystems, Germany
Glass scintillation vials (20ml)	EMS, USA	72634
Glutaraldehyde	EMS, USA	16222
Jeweler’s saw	EMS, USA	72010
Mould separating agent	Glorex, Switzerland	62407445
Osmium tetroxide	EMS, USA	19110
Paraformaldehyde	EMS, USA	RT 19208
Phosphate salts for phosphate buffer	Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Switzerland	71642 and 71496
Sodium cacodylate	Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Switzerland	20840
Sputter Coater with gold target	Cressington, USA
Tris base (TBS)	Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Switzerland	T1378
Ultramicrotome: Leica UCT	Leica Microsystems, Germany
Uranyl acetate	EMS, USA	RT 22451