Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Résumé

La vidéo montre le présent une méthode qui prend avantage de la combinaison de l'électroporation et la microscopie confocale pour l'imagerie en direct sur chaque cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur poisson zèbre en développement. In vivo L'analyse du développement des cellules progénitrices neurales du cerveau antérieur à un niveau clonal peut être réalisé de cette façon.

Résumé

Schémas précis de la division, la migration et la différenciation des cellules progénitrices neurales sont cruciales pour le développement du cerveau et ^1,2 fonction. Pour comprendre le comportement des cellules progénitrices neurales dans le complexe dans un environnement in vivo, imagerie time-lapse en direct de cellules progénitrices neurales dans un cerveau intact est absolument nécessaire. Dans cette vidéo, nous exploitons les caractéristiques uniques des embryons de poisson zèbre pour visualiser le développement des cellules progénitrices neurales du cerveau antérieur in vivo. Nous utilisons d'électroporation génétiquement et peu d'étiquettes individuelles cellules progénitrices neurales. En bref, des constructions d'ADN codant pour des marqueurs fluorescents ont été injectées dans le ventricule du cerveau antérieur de 22 heures après fécondation (HPF) et les embryons de poissons zèbres impulsions électriques ont été livrés immédiatement. Six heures plus tard, les embryons de poissons zèbres électroporées ont été montés avec bas point de fusion de verre dans des plats d'agarose culture sur le fond. Marqués par fluorescence des cellules progénitrices neurales ont ensuite été imagés pour les 36 heures avec des intervalles fixes sous un microscope confocal à l'aide d'eau plongeant objectif. La méthode actuelle fournit un moyen d'avoir un aperçu dans le développement in vivo des cellules progénitrices neurales du cerveau antérieur et peut être appliquée à d'autres parties du système nerveux central de l'embryon de poisson zèbre.

Protocole

1. Préparation des embryons de poissons zèbres

1. Deux jours avant l'électroporation, mis en place des cages d'accouplement des poissons de type sauvage en utilisant des diviseurs d'hommes séparés des femelles.
2. Un jour avant l'électroporation, tirez les diviseurs de l'accouplement des cages de la journée précédente.
3. Recueillir des embryons et incuber 50 embryons fécondés in 30 ml de milieu contenant embryonnaire phénylthiourée 0,003% (PTU) à 28,5 ° C.
4. Le jour de l'électroporation, les embryons dechorionate manuellement avec une pince fine (Inox 5, Dumont électronique, Suisse) où les embryons atteignent le stade de développement 2....

Discussion

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour imagerie time-lapse en direct de cellules progénitrices neurales au niveau clonal dans le prosencéphale poisson zèbre en développement. Nous avons testé et modifié les protocoles existants électroporation ^4-6 pour génétiquement et par fluorescence étiquette individuelle des cellules progénitrices neurales. Un arbre lignée composée de cellules par clonage progéniture connexes peuvent être mis en place depuis seulement quelques cellules ont été marqués avec un .......