Dérivation des thymique lymphome à cellules T à partir des lignes Atm - / - Et - / - Souris

Résumé

Dans cette vidéo, nous démontrons un protocole pour établir la souris des lignées cellulaires de lymphome thymique. En suivant ce protocole, nous avons établi avec succès plusieurs lignées de lymphocytes T de l'ATM-/ - et p53-/ - ont un lymphome thymique.

Résumé

Des lignées cellulaires établies sont un outil de recherche critique qui peut réduire l'utilisation des animaux de laboratoire dans la recherche. Certaines souches de souris génétiquement modifiées, telles que ATM ^{- / -} et p53 ^{- / -} constamment développer un lymphome thymique tôt dans la vie ^1,2, et donc, peut servir comme une source fiable pour la dérivation de cellules T murines lignes. Nous présentons ici un protocole détaillé pour le développement des établis murin thymique lymphome à cellules T lignes sans avoir besoin d'ajouter les interleukines comme décrit dans les protocoles antérieurs ^1,3. Les tumeurs ont été récoltés à partir des souris âgées de trois à six mois, à la première indication de tumeurs visibles basée sur l'observation d'une posture voûtée, respiration laborieuse, le toilettage pauvres et gaspiller dans une souche sensible ^1,4. Nous avons établi avec succès plusieurs lignées de lymphocytes T en utilisant ce protocole et de souches pures de l'ATM ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] ² et p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] ⁵ souris. Nous avons également démontré que plus de 90% de la place des cellules T CD3 population exprime, CD4 et CD8. Conformément aux lignées cellulaires établies de façon stable, les cellules T générées par l'utilisation du présent protocole ont été repiquées pendant plus d'un an.

Protocole

1. La dissection de la tumeur

1. Pour la dissection tumorale, une serviette en papier propre ou jetable drap chirurgical est placé sur le pavé de dissection et pulvérisé avec de l'éthanol à 70%.
2. Souris pour ce protocole sont systématiquement euthanasiés avec du CO _2. Placez la souris euthanasiées sur le pavé de dissection et de pulvérisation des deux côtés de l'animal avec de l'éthanol. La souris est maintenu en place sur le pad de dissection en utilisant quatre ou plus punaises inséré par les jambes et pulvérisé à fond avec de l'éthanol à 70%.
3. La peau sur la ligne médiane est coupé du pubis à la base de la tête par l'aide de ci....

Discussion

Dans ce protocole, nous fournir des procédures détaillées pour établir murin lignées de lymphocytes T à partir de deux génotypes différents de souris; ATM ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] et p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] . En utilisant ce protocole, un total de 6 (sur 7 tentatives) ATM ^{- / -} et trois (sur 5 tentatives) p53 ^{- / -} murins lignées de lymphocytes T ont été établis dans notre laboratoire.......

Matériaux

• Seau à glace
• 70% d'éthanol
• Dissection pad composé de bloc de mousse recouvert de papier d'aluminium et des épingles
• Deux séries de petits ciseaux stériles et
• Stérile 150 mm ² boîte de Petri (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA;. # Cat 08-757-13)
• Stérile aiguilles de calibre 18
• 50 ml tubes coniques (Corning Inc, Corning NY; cat # 430829)
• 10% du formol tamponné
• Flacons de culture tissulaire
  • T-25 (PPT, Trasadingen, Suisse; cat # 90025)
  • T-75 (PPT, Trasadingen, Suisse; cat # 90075)
• Plaques 6 puits (Corning Inc, Corning NY; cat # 3506)
• Phosphate stérile tamponné pH salines 7,2 (PBS)
• Le milieu de culture
  • RPMI 1640 avec 25 mM HEPES, 200 mM de L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat # 12-115F) complémenté avec les éléments suivants:
    • Chaleur de 10% inactivé (56 ° C, 30 min) de sérum de veau fœtal (FBS; Hyclone, Logan, UT; # cat SH30088.03)
    • 1% et la pénicilline streptomycine (Mediatech, Manassas, en Virginie, cat # 30-002-CI)
    • 1% acides aminés non essentiels (Mediatech; cat # 25-025-CI)
    • 55 mM 2β-mercaptoéthanol (Sigma, St Louis, MO, chat # M752)
• Diméthylsulfoxyde (DMSO; Calbiochem, La Jolla, en Californie, cat # 317275)
• Anticorps (eBioscience, San Diego, CA)
  • anti-CD3-FITC (cat. # 11-0031-85)
  • anti-CD4-APC (cat. # 17-0041-83)
  • anti-CD8-PE (cat. # 12-081-85)
• Albumine sérique bovine (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY;. # Cat 11018-017)
• Concanavaline A (chat Sigma # C5275)
• 1,8 flacons de gel ml (Nunc, Roskilde, Danemark; cat # 368632)