Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic
Summary
שיטה יעילה להשגת מטוהרים שברים meiotic קיימא מהעכבר testis מתואר, המשלבת תא מעודן דיסוציאציה פרוטוקול עם מיון פלורסנט התא הפעיל (FACS). שיטה זו מנצלת את ההבדלים בתוכן דנ"א צפיפות גרעינית של שברים meiotic בדידים.
Abstract
אופי הטרוגני של סוגי תאים ב testis ואת היעדרם של מודלים תרבות meiotic תא היו מכשולים משמעותיים כדי ללמוד את התוכניות התמיינות ייחודית כי הם לידי ביטוי במהלך המיוזה. שתי השיטות העיקריות פותחו כדי לטהר, בדרגות שונות, שברים meiotic שונים למבוגרים והן בבעלי חיים מפותחים: elutriation או Staput (שקיעה) באמצעות BSA ו / או percoll הדרגתיים. שתי שיטות אלה מסתמכים על גודל התא וצפיפות להפריד תאים meiotic 1-5. בסך הכל, למעט אוכלוסיות תאים ספורים 6, פרוטוקולים אלה אינם מצליחים להניב טוהר מספקת של אוכלוסיות רבות תא meiotic הדרושים ניתוחים מולקולריים מפורט. יתר על כן, עם שיטות כאלה בדרך כלל סוג אחד של תאים meiotic יכול להיות מטוהרים בזמן נתון, אשר מוסיפה רמה נוספת של מורכבות לגבי שחזור והומוגניות כאשר משווים דגימות תאים meiotic.
כאן אנו מתארים שיטה מעודן המאפשר אחד כדי לחזות בקלות, לזהות ולטהר תאים meiotic, החל בתאי הנבט כדי spermatids עגול, באמצעות FACS בשילוב עם מכתים 33342 Hoechst 7,8. שיטה זו מספקת תמונה כוללת של תהליך meiotic כולו מאפשר מאוד לטהר את התאים קיימא משלב ביותר של המיוזה. תאים אלה מטוהרים אז יכול להיות ניתח בפירוט את השינויים המולקולריים שמלווים התקדמות דרך המיוזה, שינויים בביטוי הגנים למשל 9,10 ואת הדינמיקה של תפוסה הנוקלאוזום על נקודות חמות של רקומבינציה meiotic 11.
Protocol
Discussion
פרוטוקול המוצג לעיל מאפשר בו זמנית לטהר מעכברים זכר בוגר את כל טווח של תאים בשלב meiotic עם הטוהר גבוהה מאוד, ומאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של התהליך הבסיסי הזה. תאים מטוהרים יכול לשמש עבור יישומים רבים, החל 9,10 מיצוי RNA, מיפוי הנוקלאוזום 11, גילוי מולקולה רקו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן בחלקו על ידי כספי ממדינת פלורידה סקריפס ומספרי הפרס R01GM085079 ו R21HD061304 מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית לבין המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, בהתאמה. זהו כתב היד מספר 20917 של מכון המחקר סקריפס.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
| Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
| Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
| 6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Purification, A. R. culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Namekawa, S. H. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).
- Lassalle, B. Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131, 479-487 (2004).
- Bastos, H. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. Genetic analysis of variation in human meiotic recombination. PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).
- Roig, I. Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis. PLoS Genet. 6, (2010).
- Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots. EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).
- Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis. Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).
