Здесь мы показываем, как использовать Расстояние Лигирование анализ (НОАК), при этом сочетание антител к себе костные морфогенетические белки (BMP) сигнализации в фиксированных клетках. Эта техника позволила нам следовать ядерной накопления эндогенных BMP активированный эффекторных комплексов и количественной оценки их уровня в течение долгого времени под BMP4 стимуляции.
БМП отвечают за широкий спектр развития и биологических эффектов. BMP рецепторы активировать (фосфорилировать) Smad1/5/8 эффекторы, которые затем образуют комплекс с Smad4 и транслокации в ядро, где они функционируют как факторы транскрипции инициировать BMP конкретных вниз по течению 1. Традиционные иммунофлуоресценции методы с антителами против фосфо-Smad пептиды проявляют низкую чувствительность, высокий фон и предлагают валового количественного поскольку они полагаются на интенсивность сигнала антител особенно если это светочувствительный флуоресцентные. Кроме того, фосфо-Smads не могут все быть в комплексе с Smad4 и занимается активной транскрипции.
В месте НОАК технология способна обнаруживать белковых взаимодействий с высокой специфичностью и чувствительностью 2-4. Эта новая технология пары антител признание с амплификации ДНК суррогат белка. Он генерирует локализован, дискретный сигнал в виде пятен выявления точного положения признании события. Количество сигналов, можно подсчитать и по сравнению обеспечение измерений. Мы обратились на месте НОАК, используя комплект Duolink, с комбинацией антитела, которые позволяет обнаружить BMP эффекторов сигнализации phospho-Smad1/5/8 и Smad4 только тогда, когда они находятся в непосредственной близости т.е. в комплекс, который происходит только с сигнализацией активации. Это позволило впервые, визуализации и измерения эндогенных BMP сигнализации с высокой специфичностью и чувствительностью в эксперименте время курс под BMP4 стимуляции.
Визуализации белковых комплексов в местах пользуется большим спросом, особенно для исследований в сигнализации, где взаимодействие белков и модификации, означает, что клетки используют для отправки сигнала с их поверхности к ядру. Это не удалось визуализировать и количественно комплексов между двумя эндогенных белков в месте с иммунофлюоресценции раньше. Сотрудничество локализации антител экспонатов низкого разрешения и не может использоваться для визуализации истинное взаимодействие. НОАК новую технику, что исследователи начали использовать в различных системах с большим успехом 6, 7. Здесь мы показываем, как использовать НОАК не только визуализировать, но и количественно эндогенных комплексами между Smad эффекторов активирован ниже по течению от стимуляции BMP с течением времени. Мы использовали различные ткани культуре клеток, включая Neuro2a и полагались на коммерческие антитела поднял у разных видов (мышь-Smad4 и кролика aP-Smad1/5/8) для достижения этой цели (рис. 1). Этот метод позволил нам, в первый раз, чтобы увидеть активации эффекторных БМП-комплексы с течением времени, а не просто наличие фосфорилированных Smad1/5/8, которые не все могут заниматься активными комплексами с Smad4. Мы насчитали сигналов (рис. 1F) и по сравнению измерение с количественной получена из иммуноблота из тех же клеток 8 (рисунок 1С). Мы пришли к выводу, что число пятен обеспечивают точных сравнительных измерений уровней сигнализации с течением времени. Техника была применена на других линиях клеток (HEK293T и Cos7) с аналогичными результатами (данные не приведены).
Принцип технологии основан на две уникальные зонды поставляемые в наборе Duolink. Каждый зонд НОАК состоит из вторичного антитела придает уникальный синтетический олигонуклеотид, который выступает в качестве репортера. Близость зондов позволяет ДНК перевязки на точное место, где эти зонды крепятся в непосредственной близости. Расстояние олигонуклеотидов, которая позволяет гибридизации ДНК и перевязки мала (<40 нм) и, следовательно, только белки, взаимодействующие может позволить труб. Лигируют ДНК затем может быть усилен и обнаружены с гибридизации меченых олигонуклеотидов усиливается последовательности. Усиление конкретных поскольку оно зависит от ДНК-ДНК гибридизации принципы, а также обеспечивает высокую чувствительность, как лигируют ДНК усиливается в несколько раз приводит к повышению исходное событие труб. Амплифицированной ДНК обнаружено путем гибридизации с мечеными олигонуклеотидов и производит видимый и довольно большое место. Как пятна можно пересчитать, сигнал НОАК обеспечивает не только точное пространственной информации (расположение событий взаимодействия), но и цель способом количественной оценки этих событий 2-4.
Другие методы, которые используются для обнаружения белковых взаимодействий включают в себя совместное иммунопреципитации, immunofluoresence и флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET). Сотрудничество иммунопреципитации тесты широко используются позволяет изоляции белковых комплексов. Метод сопровождается иммуноблоттинга что означает, что белки должны быть выражены на относительно высоком уровне для того, чтобы быть обнаружены. Проблемы высокого фона или неспецифическое связывание некоторых белков в бисер иногда трудно преодолеть в сотрудничестве иммунопреципитации. Кроме того, совместно иммунопреципитации анализов позволяющие выявлять белки, которые могут быть частью белкового комплекса, но не может выделить те, которые находятся в непосредственной близости взаимодействующих физически друг с другом. Кроме того, совместно immunoprecipitations не может обеспечить количественный в одной резолюции ячейки или информацию о локализации белковых комплексов в клетку. Обнаружение совместного существования белковых комплексов в клетку или ячейки отсека immunofluoresence основана на перекрытие рассеянного сигнала и, следовательно, имеет низкое пространственное разрешение и не может дать точной информации о белковых взаимодействий. Количественная оценка immunofluoresence сигнал может быть сделано путем визуальной оценки, только если разница в несколько раз, и не могут быть точными и измеримыми, как пятна НОАК. FRET позволяет визуализации белковых комплексов в живых клетках и преодолевает необходимость антител и воздействия эпитоп. Тем не менее, FRET обычно зависит от гиперэкспрессия искусственного плавленого белков, которые могут не отражать эндогенных белковых комплексов, как в НОАК.
Блокировка условия в НОАК протокола являются критическими, как антитела агрегации может произойти и увеличение фона. Альтернативные блокирование условия можно найти в листах антител продукта. Соответствующие управления с первичными и вторичными антителами упущение предоставить информацию о том, что, возможно, пошли не так, и они должны быть всегда включены. Важно, чтобы показать на экране различные антитела, которые дадут мере фоновом режиме, когда они используются одни и лучший сигнал, когда они вместе. Фиксация челLs имеет решающее значение как чрезмерная фиксация может привести к белковых комплексов, чтобы полностью денатурировать и деградировать, в то время как недостаточная фиксация может привести к потере белковых комплексов во время шагов процедуры. Это можно контролировать за счет снижения концентрации фиксатором до 3%, или на ограничение времени фиксации. Тем не менее, фиксация зависит также от того, первичные антитела распознают денатурированные белки или нет. Как техника НОАК очень чувствительна, особое внимание необходимо для поддержания времени инкубации и микро условиях равного среди разных образцов.
Образцы не должны быть оставлены на сухой в любом случае до последнего шага. Сушка образцов может привести к повышению фона. Полное удаление блокирующий раствор также имеет важное значение для того, чтобы избежать фона. Мыть буферы всегда должны быть доведены до комнатной температуры перед использованием, как низкая температура замедляет ферментативных реакций. Для дальнейшего поиска неисправностей обратитесь к руководству Kit.
Полезно использовать пятна установить субклеточном локализации НОАК сигнала (например DAPI, актин и т.д.). Здесь мы использовали DAPI (в монтажной средой) для окрашивания ядер. PLA совместима с использованием иммунофлюоресценции с антителами для определения типа клеток или клеточного отсека (не показана здесь). Точная количественная может быть сделано путем подсчета сигналов и использование специального программного обеспечения (Duolink Image Tool, OLink Biosience).
В заключение мы продемонстрировали, как использовать на месте НОАК, используя комплект Duolink обнаружить BMP сигнализации в фиксированных клеток и представила свои преимущества: проста в использовании, высокой чувствительностью, не фон, а уникальная способность количественно активных BMP сигнализации на месте.
Ограничение применения этого метода для изучения различных взаимодействий белков зависит от доступности и качества первичных антител, которые признают белков под следствием.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование финансируется за счет MRC и СИББН грантов. Мы благодарим Агата Zieba и Катерина Pardalis в Лаборатории Ульф Landegren, в университете Упсалы за помощь в создании техники и полезные советы. OLink Biosience технической помощи и презентации.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
GMEM | Invitrogen | 21710025 | ||
DMEM | Invitrogen | 21063029 | ||
FBS | AutogenBioclear | 7.01 | ||
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11149068 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | ||
Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-054 | ||
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | ||
16-well chamber slides | Lab-Tek | 178599 | ||
Polysine | VWR | 631-0107 | ||
Cover glass | VWR | 631-0138 | ||
a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling | 9511 | ||
a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7966 | ||
Dorsomorphin | Merck | 171260-10MG | ||
Recombinant Mouse BMP-4 | R&D | 5020-BP-010 | ||
PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | ||
Tween-20 | Promega | H5151 | ||
Duolink II Detection Reagents (Orange) | OLINK | 92007-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | ||
Duolink II Mounting Medium with DAPI | Olink Bioscience | 82040-0005 | ||
Duolink II Wash Buffers Fluorescence | Olink Bioscience | 82049 |