Técnicas simples são descritos para a produção rápida de microfabricated sistemas de cultura neural usando um dispositivo de microespelhos digitais para litografia dinâmica máscara de projeção em substratos de cultura de células regulares. Estes sistemas cultura pode ser mais representativo da arquitectura biológica natural, e as técnicas descritas podem ser adaptadas para inúmeras aplicações.
Cada vez mais, ambientes de cultura de células padronizadas estão se tornando uma técnica relevante para estudar características celulares, e muitos pesquisadores acreditam na necessidade de ambientes 3D para representar experimentos de vitro que imitar melhor em qualidades vivo 1-3. Estudos em áreas como a pesquisa do câncer 4, engenharia neural 5, fisiologia cardíaca 6, e célula-matriz de interação 7,8 têm mostrado o comportamento das células difere substancialmente entre as culturas tradicionais monocamada e construções em 3D.
Hidrogéis são utilizados como ambientes 3D devido à sua diversidade, versatilidade e capacidade de composição molecular sob medida através de funcionalização 9-12. Numerosas técnicas existem para a criação de construções como células de suporte matrizes, incluindo electrospinning 13, selos de elastômero 14, impressão jato de tinta 15, photopatterning aditivo 16, fotomáscara estática litografia de projeção-17, e microstereolithography máscara dinâmica 18. Infelizmente, esses métodos envolvem várias etapas de produção e / ou equipamentos não é facilmente adaptável a célula e métodos convencionais de cultura de tecidos. A técnica empregada neste protocolo adapta os dois últimos métodos, usando um dispositivo de microespelhos digitais (DMD) para criar máscaras dinâmicas para crosslinking geometricamente específicas poli (etileno glicol) (PEG) hidrogéis, induzida através da polimerização UV iniciada de radicais livres. O resultado do "2.5D" estruturas de fornecer um ambiente restrito em 3D para o crescimento neural. Nós empregamos uma abordagem dual-hidrogel, onde PEG serve como uma estrutura de células-região restritivas para fornecer uma outra maneira disforme, mas células permissivas gel auto-montagem feita a partir de qualquer Puramatrix ou agarose. O processo de fabricação é uma etapa rápida e simples um que é altamente reprodutível e facilmente adaptado para uso com métodos convencionais de células de cultura e substratos.
Explantes tecido inteiro, como gânglios da raiz dorsal embrionária (DRG), podem ser incorporadas ao hidrogel constrói dupla para ensaios experimentais, tais como crescimento de neuritos. Além disso, células dissociadas pode ser encapsulado no hidrogel photocrosslinkable ou auto-polimerização, ou seletivamente aderidas à membrana suporte permeável usando células-restritivas photopatterning. Usando o DMD, criamos hidrogel construções até ~ 1 mm de espessura, mas de película fina (<200 mm) estruturas PEG foram limitados pela têmpera de oxigênio da reação de polimerização por radicais livres. Nós posteriormente desenvolveu uma técnica utilizando uma camada de óleo acima do líquido de polimerização que permitiu a polimerização estrutura fina PEG.
Neste protocolo, descrevemos a criação rápida de sistemas de hidrogel 3D para a produção de células neurais e microfabricated culturas de tecidos. As construções de hidrogel dupla demonstrou aqui representam versáteis modelos de vitro que podem ser úteis para estudos em neurociência que envolvem a sobrevivência da célula, migração e / ou crescimento neurite e orientação. Além disso, como o protocolo pode funcionar para muitos tipos de hidrogéis e células, as possíveis aplicações são variadas e vastas.
O método descrito aqui pode ser usado por qualquer pesquisador que procuram sistemas de cultura de células simples e reprodutível. Teoricamente, devido à grande variedade de hidrogéis fotopolimerizável disponíveis, o ambiente pode ser adaptado para permitir o uso com qualquer tipo de célula, incluindo explantes tecido inteiro. Além disso, o sistema de hidrogel dupla permite o controle espacial melhorada na apresentação de auto-polimerização hidrogéis, que tendem a formar formas amorfas por conta própria. O resultado do "2.5D" constrói hidrogel micropatterned fornecer uma matriz 3D para o crescimento neural apresentado em uma configuração 2D que permite a avaliação microscópica conveniente. O substrato sobre o qual os géis são polimerizados também podem ser variadas, permitindo maior controle no delineamento experimental. Nossos métodos são otimizados para uso com suportes de cultura de células permeáveis, como vimos melhoria da viabilidade (Figura 4), em comparação com a polimerização em lâminas de vidro (dados não mostrados). No entanto, outras superfícies de polimerização pode ser mais aplicável para diferentes aplicações: fabricação em lâminas de vidro utilizado em experimentos microfluídica ou formações agregado de células, por exemplo.
Nossa experiência com esses sistemas de cultura levou à identificação de áreas potenciais de dificuldade. Primeiro, as técnicas de cuidado são necessários para manter a esterilidade das construções. Devido à natureza volumosos da configuração do DMD, é difícil de operar as etapas de polimerização sob condições estéreis. Para combater este problema, a etapa de lavagem descrito nos métodos é útil, e os antibióticos devem ser usados em todas as mídias. Além disso, a espessura final e forma da construção polimerizado é altamente dependente do comportamento do fluido da pré-mistura de polímeros, ea presença de um menisco pode resultar em construções de gel que são muito finas ou incompleta polimerizadas (Figura 6). Dois passos podem ser tomadas para minimizar a formação de um menisco no interior insere cultura de células. Para hidrogéis de espessura (> 200 mm), um revestimento simples de X-Chuva volta a parede interna da pastilha é suficiente. No entanto, como brevemente descrito acima, para construções finas (<200 mm), uma camada de óleo é necessária para minimizar tanto o menisco e nega extinção de oxigênio da polimerização de radicais livres. Resolução foi encontrado para ser dependente de espessura, com uma diminuição no tamanho do recurso cada vez mais realizado com gel mais espesso. A resolução também variou dependendo se o recurso representou um alívio positivo ou negativo no hidrogel. No entanto, conseguimos uma resolução suficiente para construções com tamanhos traço mínimo na escala de ~ 100 mm usando objetivos microscópio apenas como foco óptica.
Nossos experimentos mostraram que o hidrogel dupla constrói aqui descritos representam uma excelente base para a formação de base in-vitro modelos de crescimento neurite e orientação. A técnica empregada micropatterning é uma adaptação dos métodos existentes 18,19, mas o nosso set-up enfatizou uma concepção simples de implementar e foi otimizado para a produção de construções de hidrogel dupla insere em cultura de células; insere cultura de células foram vitais para melhorar a viabilidade das células, assim como crosslinking torno explantes tecidos anteriormente aderente. O alcance dos resultados apresentados é limitada pelos interesses de nosso laboratório, no entanto, acreditamos que os métodos descritos nesta publicação serão úteis para os pesquisadores à procura de um método relativamente barato, rápido e fácil de usar para a fabricação de cultura celular 3D modelos.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer o laboratório do Prof Anthony Windebank para compartilhar os seus conhecimentos sobre DRG dissecção e cultura, bem como o Prof Shaochen Chen para discussões úteis a respeito da configuração do DMD. Esta pesquisa foi financiada em parte pela Tulane University e subvenções do Conselho de Regentes Louisiana (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) e os NIH (NS065374).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Digital Micromirror Device | Texas Instruments | DLPD4X00KIT | ||
Collagen Coated Transwell Permeable Support | Corning | 3491 | Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript | |
Polyester Transwell Permable Support | Corning | 3412 | Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript | |
Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | ||
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-036 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-164 | ||
Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | ||
Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | ||
B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
DPBS | Invitrogen | 14190-250 | ||
Puramatrix | BD Biosciences | 354250 | ||
PEG 1000 | Polysciences, Inc. | 15178 | ||
Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | 0298913AB | ||
Oil | Have used both canola oil and silicon oil | Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation | ||
OmniCure Series 1000 | Exfo | |||
Rain-X |