यह वीडियो प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे भेदभाव और तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं के तंत्रिका कोशिका परख कॉलोनी के गठन का उपयोग कर एक मिश्रित आबादी में सदाशयी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को एन्यूमरेट.
neurosphere परख (एनएसए) सबसे अक्सर इस्तेमाल किया तरीकों को अलग करने, विस्तार और भी तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) की आवृत्ति की गणना की है. इसके अलावा, इस सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली भी करने के लिए स्टेम सेल का विस्तार करने के लिए और ट्यूमर और सामान्य ऊतकों की एक किस्म से अपने आवृत्ति निर्धारित नियोजित किया गया. यह हाल ही में दिखाया गया है कि एक रिश्ता एक एक neurosphere गठन और एनएससी के बीच मौजूद नहीं है. यह पता चलता है कि एनएसए के रूप में वर्तमान में लागू है, दोनों भ्रूण और वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क से अलग तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी में एनएससी की आवृत्ति overestimates. यह वीडियो व्यावहारिक रूप से एक उपन्यास अर्द्ध ठोस परख आधारित कोलेजन को दर्शाता है, तंत्रिका कॉलोनी सेल (एन CFCA) परख, जो पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से स्टेम उनके दीर्घकालिक proliferative संभावित आधार पर भेदभाव करने की क्षमता है, और इस प्रकार निर्मित करना प्रदान करता है एक विधि एनएससी आवृत्ति एन्यूमरेट करने के लिए. एन CFCA ≥ 2 मिमी व्यास में कालोनियों कोशिकाओं है कि एक एनएससी के सभी कार्यात्मक मानदंडों को पूरा से निकाली गई है, जबकि कालोनियों <2mm progenitors से निकाली गई है. एन – CFCA प्रक्रिया प्राथमिक और सुसंस्कृत वयस्क या भ्रूण माउस सीएनएस कोशिकाओं सहित विभिन्न स्रोतों से तैयार की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ हम बीतने से एक भ्रूण दिन 14 चूहों के मस्तिष्क से उत्पन्न एन CFCA प्रदर्शन neurospheres तैयार कोशिकाओं का उपयोग करें. संस्कृतियों के प्रसार के माध्यम से तीन सप्ताह के लिए हर सात दिन मंगाया मढ़वाया कोशिकाओं को अपनी पूर्ण proliferative संभावित प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देते हैं और फिर तंत्रिका पूर्वज और सदाशयी तंत्रिका स्टेम सेल की आवृत्ति क्रमशः कालोनियों कि <2mm हैं की संख्या की गणना के द्वारा की गणना है और हैं कि कोशिकाओं की संख्या है कि शुरू में मढ़वाया थे के संदर्भ में ≥ 2mm हैं.
हालांकि neurosphere 3,1,2 परख सबसे आम विधि को अलग और वयस्क और भ्रूण ऊतक सीएनएस की तरह स्रोतों की एक किस्म से तंत्रिका स्टेम सेल का विस्तार है, यह सही तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी में एनएससी आवृत्ति उपाय नहीं कर सकते हैं ( स्टेम और progenitors) के रूप में वहाँ neurospheres की संख्या और सदाशयी स्टेम 4 कोशिकाओं की संख्या के बीच एक से एक रिश्ता नहीं है . इस सीमा का पता करने के लिए, मूल एनएसए इतनी अनुकूलित किया गया है के रूप में तंत्रिका स्टेम और progenitors तीन 5-7 हफ्तों के लिए अपनी पूरी प्रसार क्षमता को विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए. तरल एनएसए के विपरीत, एन CFCA कालोनियों वास्तव clonally प्राप्त कर रहे हैं, के रूप में अर्द्ध ठोस कोलेजन मैट्रिक्स एकल चढ़ाया और कोशिकाओं कालोनियों के एकत्रीकरण के प्रवास रोकता है. हम इस परख के साथ संगत परिणामों के लिए सिफारिश:
The authors have nothing to disclose.
इस काम Overstreet फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | STEMCELL | 05700 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | STEMCELL | 05701 | |
NeuroCult NCFC medium | Medium | STEMCELL | 05720 | |
0.05% trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
Collagen | Reagent | STEMCELL | 04902 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
35 mm culture dishes | Culture ware | STEMCELL | 27100 | |
Gridded scoring dishes | Culture ware | STEMCELL | 27500 |