Etudier Trajectoires Cellule roulant sur les Patterns récepteur asymétrique

Résumé

Nous décrivons un protocole d'observer et d'analyser les trajectoires de cellules roulant sur des récepteurs asymétriques des substrats. Les données obtenues sont utiles pour l'ingénierie des récepteurs des substrats pour les sans étiquette de séparation des cellules et l'analyse.

Résumé

Déplacement latéral des cellules orthogonales à un flux de circulation en roulant sur ​​les habitudes des récepteurs asymétriques présente une opportunité pour le développement de nouveaux dispositifs pour les sans étiquette séparation et l'analyse des cellules ^1. De tels dispositifs peuvent utiliser un déplacement latéral des flux continu de séparation, ou des modèles de récepteur qui modulent l'adhérence de distinguer entre les différents phénotypes cellulaires ou des niveaux d'expression du récepteur. Comprendre la nature des trajectoires de cellules roulant sur les récepteurs des substrats est nécessaire pour l'ingénierie des substrats et la conception de tels dispositifs.

Ici, nous démontrons un protocole pour l'étude des trajectoires de cellules de roulement sur ​​les habitudes des récepteurs asymétriques qui soutiennent l'adhésion des cellules de roulement ^2. Bien définis, um échelle schémas de P-sélectine récepteurs ont été fabriqués en utilisant l'impression par microcontact sur l'or-lames recouvertes qui ont été incorporées dans une chambre d'écoulement. HL60 cellules exprimant le ligand PSGL-1 ³ ont coulé à travers un champ de lignes à motifs et visualisés sur un microscope à champ clair inversée. Les cellules laminés et suivis le long des bords inclinés des motifs, résultant en ^une déviation latérale. Chaque cellule généralement roulé pour une certaine distance le long des bords motif (définie comme la longueur de suivi de bord), détaché à partir du bord, et rattaché à un modèle en aval. Bien que ce détachement, il est difficile de suivre la trajectoire entière d'une cellule de l'entrée jusqu'à la sortie de la chambre d'écoulement, de traces de particules logiciel a été utilisé pour analyser les trajectoires et le rendement de roulement des cellules pendant le temps où ils se déplacent sur un seul récepteur à motif de ligne. Les trajectoires ont ensuite été examinés afin d'obtenir des distributions de vitesses de roulement et la cellule de longueurs d'arêtes de suivi pour chaque cellule pour des motifs différents.

Ce protocole est utile pour quantifier les trajectoires de cellules roulant sur les modèles de récepteur et concernant ces paramètres d'ingénierie tels que l'angle modèle et la contrainte de cisaillement. Ces données seront utiles pour la conception de dispositifs microfluidiques pour sans étiquette de séparation des cellules et l'analyse.

Protocole

1. HL60 cellules de roulement

1.1. La fabrication des substrats à motifs.

1. En utilisant l'impression par microcontact (μCP) ^4-7 pour faire en alternance monocouches auto-assemblées (SAM) de molécules PEG sur les lames de verre recouvert d'or: Fabriquer l'impression microcontact polydiméthylsiloxane (PDMS) timbres qui définit les modèles de récepteur avec angle d'inclinaison de α = 10 ° par une SU-8 processus de moulage. Nettoyer la surface d'or avec une solution piranha (3:1 mélange d'acide sulfurique à 30% de peroxyde d'hydrogène) pendant 20 minutes puis rincer la surface avec de l'eau DI copieuses à 24,5 ° C avant util....

Discussion

Nous avons décrit un protocole pour examiner les cellules trajectoires roulant sur ​​des récepteurs asymétriques surfaces texturées fabriqué en utilisant ^deux l'impression par microcontact. Les images de microscopie optique de surface à motifs montrant contraste évident entre le PEG et le P-sélectine zones peuvent être utilisées pour confirmer si d'emboutissage est réussie. Sharp, arêtes droites peut être observé lorsque l'horodatage est bien performé. Dur appuyant sur le timbre peut entraîner des.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules humaines de leucémie promyélocytaire	ATCC	CCL-240	Cellules HL60
Plaquettes en verre recouvertes d'or	EMF	TA134	Plaquettes d'or
(1-Mercaptoundéc-11-yl)tétra(éthylène glycol)	Sigma-Aldrich	674508	PEG
P-sélectine humaine recombinante	R&D Systems	ADP3-050	P-sélectine
Albumine de sérum bovin	Rockland Immunochemicals	BSA-50	BSA
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco’s	Mediatech, Inc.	21-030	DPBS
Acide sulfurique	Sigma-Aldrich	339741
Peroxyde d'hydrogène	Sigma-Aldrich	316989