Summary
Drosophila melanogaster testes kunnen snel en efficiënt geïsoleerd van volwassen mannen met behulp van het ontleden van naalden. Met de praktijk, kan men gemakkelijk isoleren in een of twee dagen een bedrag van testes voldoende is voor de analyse van DNA of RNA door hoge throughput sequencing of meer traditionele methoden of moleculaire biologie van eiwitten voor antilichaam-of enzym-gebaseerde testen.
Abstract
De testes van Drosophila melanogaster bieden een belangrijk model voor de studie van stamcellen onderhoud en differentiatie, meiose, en soma-kiembaan interacties. Testes zijn meestal geïsoleerd uit volwassen mannetjes 0-3 dagen na Eclosion uit de popstadium geval. De testes van wild-type vliegen zijn gemakkelijk te onderscheiden van andere weefsels, omdat ze zijn geel, maar de testes van de witte mutant vliegen, een gemeenschappelijke genetische achtergrond voor laboratoriumexperimenten zijn vergelijkbaar in beide vorm en kleur aan het vliegen darm. Het uitvoeren van dissectie op een glazen microscoopglaasje met een zwarte achtergrond maakt het identificeren van de testes een stuk eenvoudiger. Testes worden verwijderd uit de vliegen met behulp van ontleden naalden. Vergeleken met de protocollen die forceps gebruiken voor testes dissectie, onze methode is veel sneller, waardoor een goed geoefend individu om testes ontleden 200-300 wild-type vliegt per uur, waardoor 400-600 testes. Testes van witte vlieg of mutanten die testes te verkleinen zijn moeilijker te ontleden en levert doorgaans 200-400 testes per uur.
Protocol
- Maak een glazen microscoopglaasje met een zwarte achtergrond: Cut 20 # wit papier van hetzelfde formaat als de microscoop dia. Kleur de ene kant van de slide-formaat papier zwart met behulp van een permanent marker (bijv. Sharpie). Van toepassing zijn witte lijm (Elmer's) naar de zwarte kant en houden het papier aan de dia. De glijbaan kan worden hergebruikt. Met behulp van ¾ "label tape (Fisherbrand), tot het veilig microscoopglaasje, glas kant, om de CO 2 vliegen pad om het te bevestigen op zijn plaats.
- Verzamel 0-3 dagen oud mannetje vliegt.
- Maak een emmer met ijs, fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), ontleden naalden.
- Verdoof 50-100 vliegt met behulp van een stroom van CO 2 en overbrengen van de fles of flacon om de vliegen pad in de buurt van het objectglaasje.
- Pipetteer ~ 50 ul ijskoud PBS in een daling in het midden van de microscoop dia.
- Voorzichtig pick-up een mannelijke vliegen met de ontleden naald-dip het ontleden naald in PBS, zachte aanraking van de ventrale zijde (dat wil zeggen, in de buurt van de vleugels) van het vliegen met de naald-plaats deze in de val van PBS.
- Plaats een naald op het midden van de vlieg, tussen de borstkas en de buik, naar beneden te duwen stevig. Plaats de andere naald tussen de zesde (A6) en zevende (A7) buik segmenten (de tweede en derde strepen van onderen), trek de buik weg van de thorax.
- Plagen van de testes, afgezien van andere organen, in het bijzonder de darm. Vooral in witte mutanten, testes en darmen lijken. De belangrijkste verschillen zijn dat testikels altijd in paren, elk testis heeft een spiraal patroon en is meer wit van kleur dan de darm.
- Bewaar de testes in ijskoud PBS in een polypropyleen microcentrifugebuis.
Representatieve resultaten:
Figuur 1. Dorsaal zicht van het mannelijke voortplantingssysteem, uit flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flybase attributie:... 'Na figuur 38 A op pagina 508 van Miller (1950) A. Miller De interne anatomie en histologie van het imago van Drosophila melanogaster In M. Demerec, redacteur, Biologie van Drosophila, hoofdstuk 6, pagina's 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, facsimile-uitgave, 1994. Copyright 1994 door Cold Spring Harbor Laboratory Press. Gebruikt met vriendelijke toestemming van Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Druk op. Zie http://www.cshlpress.com . "
Discussion
Wij bieden een protocol om teelballen te isoleren van volwassen mannelijke Drosophila melanogaster. Omdat de techniek vereist een coördinerende de twee handen, vaardigheid komt alleen met de praktijk.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs danken Vasia Vagin voor de invoering van deze techniek in ons laboratorium.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting needle | Tool | Fisher Scientific | S17346 | |
| Micro Slides, Plain | Tool | Fisher Scientific | 12-553 | |
| Microscope Light | Tool | Schott AG | KO-1500 | |
| CO2 pad | Tool | Genesee Scientific | 59-172 | |
| Benchtop Flowbuddy Complete System | Tool | Genesee Scientific | 59-122WCU | |
| Bubble Humidifier | Tool | Salter Labs | 7100 | |
| Ball filler needle | Tool | Genesee Scientific | 54-119 | |
| ¾” Label Tape | Supply | Fisher Scientific | 15-901-5B |
References
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell. Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).
