Bimolecular Fluorescens komplement
Summary
Den subcellulära lokalisering av proteiner är viktigt för att bestämma tid och rum reglering av cellsignalering. Här beskriver vi bimolecular fluorescens komplettering (BiFC) som en enkel metod för att övervaka den rumsliga interaktioner mellan proteiner i cellen.
Abstract
Definiera subcellulära fördelningen av signalering komplex är absolut nödvändigt för att förstå resultaten från den komplexa. Konventionella metoder som immunoprecipitation ger ingen information om den rumsliga lokaliseringen av komplex. Däremot övervakar BiFC samspelet och subcellulära uppdelning av proteinkomplex. I denna metod är en fluororescent protein delas upp i amino-och karboxi-terminal icke fluorescerande fragment som sedan smält till två proteiner av intresse. Växelverkan mellan proteiner resulterar i beredning av fluoroforen (Figur 1) 1,2. En begränsning av BiFC är att när den fragmenterade fluoroforen löses komplexet är oåterkallelig 3. Denna begränsning är en fördel i att upptäcka flyktiga eller svag växelverkan, men utesluter en kinetisk analys av komplexa dynamik. En extra varning är att den rekonstituerade flourophore kräver 30min att mogna och fluorescerar, återigen utesluter observation av realtid interaktioner 4. BiFC är ett konkret exempel på det protein fragment komplettering analys (PCA) som sysselsätter reporter proteiner såsom grönt fluorescerande protein varianter (BiFC), dihydrofolatreduktas, B-betalaktamas och luciferas att mäta protein: protein interaktioner 5,6. Alternativa metoder för att studera protein: protein interaktioner i celler inkluderar fluorescens co-lokalisering och Förster resonans energiöverföring (FRET) 7. För co-lokalisering, är två proteiner individuellt märkta antingen direkt med en fluoroforen eller genom indirekt immunofluorescens. Leder dock detta sätt att hög bakgrund av icke-interagerande proteiner vilket gör det svårt att tolka co-lokalisering data. Dessutom, på grund av gränserna för upplösning konfokalmikroskopi kan två proteiner som visas samarbete lokaliserad utan att nödvändigtvis interagera. Med BiFC är fluorescens endast observerats när de två proteiner av intresse interagerar. FRET är en annan utmärkt metod för att studera protein: protein interaktioner, men kan vara tekniskt utmanande. FRET experiment kräver givare och acceptanten vara av liknande ljusstyrka och stökiometri i cellen. Dessutom måste ett konto för blöda igenom av givaren i acceptanten kanalen och vice versa. Till skillnad från FRET har BiFC lite bakgrundsfluorescens, lite efterbearbetning av bilddata, inte kräver hög överuttryck, och kan upptäcka svaga eller transienta interaktioner. Bioluminescence resonans energy transfer (BRET) är en metod som liknar FRET utom givaren är ett enzym (t ex luciferas) som katalyserar ett substrat för att bli självlysande och därmed spännande en acceptor. BRET saknar de tekniska problemen vid blöda igenom och hög bakgrundsfluorescens men saknar förmåga att tillhandahålla geografisk information på grund av bristen av substrat lokalisering till specifika fack 8. Sammantaget är BiFC en utmärkt metod för att visualisera subcellulära lokalisering av proteinkomplex att få insikt i compartmentalized signalering.
Protocol
Discussion
BiFC är en utmärkt metod för att visualisera protein: protein interaktioner i hela celler och bestämma subcellulära lokalisering av dessa komplex. Fördelarna med BiFC är att endast interagerar proteiner är fluorescerande, är övergående interaktioner stabiliserats, och efter bearbetning av bilddata är minimal. Två nackdelar med denna metod är mognaden tid för fluoroforen och oåterkallelig fluoroforen komplex. Enligt vissa program här oåterkallelig kan användas som en fördel. Till exempel kan man anvä…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den ITSN, PI3K-C2β, och vektorer kontrollinstrument som används i detta protokoll är tillgängliga från författarna på begäran, för icke-kommersiella syften. Författarna vill tacka Dr Chang-Deng Hu för snällt att ge råd och reagenser som används i upprättandet av BiFC protokollet i O'Bryan laboratoriet. KAW stöddes av medel från stiftelsen Jerome Lejeune. Arbetet i O'Bryan laboratoriet stöds av anslag från NIH (HL090651), DOD (PR080428), S: t Baldrick Stiftelse och Stiftelsen Jerome Lejeune.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-013 | ||
| Fetal bovine serum | Cellgro | 35-011-CV | ||
| Glass Bottom Microwell dishes | Matek | P35G-1.5-14C | ||
| 6-well dishes | Falcon | 35-3846 | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 18324020 | ||
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | ||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 META |
References
- Kerppola, T. K. Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40, 61-66 (2006).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies. Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).
- Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA). Methods. 40, 287-293 (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).
- Martin, N. P. Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling. Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).
- Das, M. Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3′-kinase C2beta-AKT pathway. Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).
- Mohney, R. P. Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving. JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).
- Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O’Bryan, J. P., McPherson, P. S. Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis. J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).
- Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O’Bryan, J. P. Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways. J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).
- O’Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. Mitogenesis and endocytosis: What’s at the INTERSECTIoN?. Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).
