Fluorescencia de Complementación bimolecular
Summary
La localización subcelular de las proteínas es importante para determinar la regulación espacio-temporal de la señalización celular. Aquí se describe la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) como un método sencillo para el control de la interacción espacial de las proteínas en la célula.
Abstract
La definición de la distribución subcelular de los complejos de señalización es imprescindible para entender el resultado de ese complejo. Los métodos convencionales, tales como la inmunoprecipitación no proporcionan información sobre la localización espacial de los complejos. Por el contrario, BiFC supervisa la interacción y la compartimentación subcelular de los complejos de proteínas. En este método, una proteína fluororescent se divide en amino-y carboxi-terminal no fluorescente fragmentos que se fusionan dos proteínas de interés. La interacción de los resultados de las proteínas en la reconstitución del fluoróforo (Figura 1) 1,2. Una limitación de BiFC es que una vez que el fluoróforo fragmentada se reconstituye el complejo es irreversible 3. Esta limitación es una ventaja en la detección de interacciones transitorias o débil, pero se opone a un análisis cinético de la compleja dinámica. Una advertencia adicional es que el flourophore reconstituido requiere 30 minutos para madurar y fluorescentes, una vez más se opone a la observación de las interacciones en tiempo real 4. BiFC es un ejemplo específico de la proteína de ensayo de complementación de fragmentos (PCA), que emplea las proteínas reportero como el verde variantes de la proteína fluorescente (BiFC), la dihidrofolato reductasa, b-lactamasa, y luciferasa para medir las proteínas: las interacciones proteína 5,6. Métodos alternativos para el estudio de proteínas: las interacciones de proteínas en las células incluyen fluorescencia co-localización y transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) 7. De co-localización, dos proteínas son etiquetados individualmente, ya sea directamente con un fluoróforo o por inmunofluorescencia indirecta. Sin embargo, este enfoque lleva a un segundo plano alto de la no interacción de proteínas por lo que es difícil de interpretar co-localización de los datos. Además, debido a los límites de la resolución de la microscopía confocal, dos proteínas pueden aparecer co-localizados sin necesidad de interactuar. Con BiFC, la fluorescencia sólo se observa cuando las dos proteínas de interés interactúan. FRET es otro método excelente para el estudio de las proteínas: las interacciones proteína, pero puede ser técnicamente difícil. FRET experimentos requieren el donante y el receptor a ser un brillo similar y la estequiometría de la célula. Además, uno debe tener en cuenta para sangrar a través de los donantes en el canal aceptor y viceversa. A diferencia de FRET, BiFC tiene pocos antecedentes de procesamiento de fluorescencia, poco después de los datos de imagen, no requiere de la sobreexpresión de alta, y puede detectar interacciones débiles o transitoria. Bioluminiscencia la transferencia de energía de resonancia (BRET) es un método similar al FRET salvo que el donante es una enzima (luciferasa, por ejemplo) que cataliza un sustrato para ser bioluminiscentes lo emocionante aceptador. BRET carece de los problemas técnicos de la sangre a través de la fluorescencia de fondo y alto, pero carece de la capacidad de proporcionar la información espacial, debido a la falta de localización del sustrato a compartimentos específicos 8. En general, BiFC es un excelente método para visualizar la localización subcelular de los complejos de proteínas para profundizar en la señalización en compartimientos.
Protocol
Discussion
BiFC es un excelente método para la visualización de proteínas: las interacciones de proteínas en células enteras y la determinación de la localización subcelular de estos complejos. Las ventajas de BiFC es que sólo las proteínas que interactúan son fluorescentes, las interacciones transitorias se han estabilizado, y post-tratamiento de los datos de imagen es mínima. Dos desventajas de este método son el tiempo de maduración para el fluoróforo y la irreversibilidad de la compleja fluoróforo. En algunas ap…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El ITSN, PI3K C2β-, y el control de vectores utilizados en este protocolo están disponibles a partir de los autores que lo soliciten para fines no comerciales solamente. Los autores desean agradecer al Dr. Chang-Deng, Hu por la amabilidad de prestar asesoramiento y los reactivos utilizados en el establecimiento del protocolo BiFC en el laboratorio O'Bryan. KAW fue apoyado por fondos de la Fundación Jerome Lejeune. Trabajo en el laboratorio O'Bryan es apoyado por subvenciones del NIH (HL090651), DOD (PR080428), la Fundación San Baldrick, y la Fundación Jerome Lejeune.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-013 | ||
| Fetal bovine serum | Cellgro | 35-011-CV | ||
| Glass Bottom Microwell dishes | Matek | P35G-1.5-14C | ||
| 6-well dishes | Falcon | 35-3846 | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 18324020 | ||
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | ||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 META |
References
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