Två-foton avbildning har avslöjat lymfocyter motilitet och cellulära interaktioner inom den lymfkörtel i basala förhållanden och under ett immunsvar 1. Här visar vi adoptiv transfer av T-celler, isolering av lymfkörtlar, och avbildning motilitet av CD4 + T celler i explanterade lymfkörtel.
Två-foton avbildning har avslöjat en elegant koreografi motilitet och cellulära interaktioner inom den lymfkörtel i basala förhållanden och vid inledandet av ett immunsvar 1. Här presenterar vi metoder för adoptiv transfer av märkta T-celler, isolering av lymfkörtlar, och avbildning motilitet av CD4 + T celler i explanterade lymfkörtel som första beskrivs i 2002 2. Två-foton avbildning av immunceller kräver att cellerna fluorescerande är märkta, antingen genom färgning med en cell tracker färgämne eller genom att uttrycka ett fluorescerande protein. Vi visar det adoptiv förfarandet för överföring av injicera celler från givare möss i svansen ven av en mottagare djur, där de hem till lymfoida organ inom ca 15-30 min. Vi illustrerar isolering av en lymfkörtel och beskriva metoder för att säkerställa korrekt montering av exciderad lymfkörtel. Andra överväganden som bra syresättning av perfusion media, temperatur, och laser makt diskuteras. Slutligen presenterar vi 3D-bilder av naiva CD4 + T-celler uppvisar steady state motilitet vid 37 ° C.
I den här videon protokoll visar vi de förfaranden som adoptiv cell överföring och lymfkörtel isolering och förberedelser som krävs för avbildning lymfocyter motilitet i en perifer lymfkörtel. Två-foton avbildning har flera fördelar jämfört konfokala bildhantering i både explanterade vävnader (bilden) och i intravital förberedelser. Särskilt användning av infraröd excitation minimerar ljusspridning och möjliggör avbildning ~ 300 mikrometer under kapsel av lymfkörteln och djupare i vissa vävnader 4. Dessutom är flera fotonen excitation begränsad till fokus för målet att minimera foto blekning och vävnadsskada ut sida fokalplanet. Som med alla nya tekniken är dock två-photon avbildning ingen patentlösning och dess begränsningar och potentiella fallgropar måste hållas i minnet 5. Bland dessa är kravet på att – med undantag för inneboende signaler som andra harmonic generation av kollagen-celler av intresse fluorescerande måste märkas med yttre givare eller uttryck av fluorescerande proteiner. Intrycket är således skapas dessa märkta celler simmar i ett svart tomrum, medan det i sanning de är nedsänkta i och interagera med en komplex miljö av strukturella element och en mängd andra omärkta, osynliga celler.
Under de sex år som gått sedan införandet av två-photon avbildning för immunologi, har denna teknik får forskarna att lösa långvariga frågor genom att direkt visualisera i intakta levande vävnader processer inklusive cell-cell interaktioner, cell motilitet och lokalisering, cellulära signalvägar och cytotoxiska celler döda händelser. Fältet har snabbt utvecklats bortom första fenomenologiska beskrivningar och kvantitativa analyser tillsammans med datormodellering och simulering börjar nu att förstå hur den till synes kaotiska cellulära rörelser och interaktioner inom lymfkörtlar leda till en effektiv immunsvar. Denna utveckling är omfattande över en nyligen publicerad 1, som listar över 100 artiklar som beskriver tillämpningen av två-photon mikroskopi för immunoimaging.
Vi vill tacka Rebecca Paquette för hjälp med REAGENSBEREDNING. MPM stöds av en Ruth L. Kirchstein predoctoral stipendium från National Institutes of Health och stöd från bidrag GM-41.514 (MDC), NS-48.252 (KGC), GM-48.071 (IP) även från National Institutes of Health.