पूर्ण मोटाई वयस्क सुअर रेटिना के Organotypic संस्कृति
Summary
यहाँ हम सात दिनों के लिए एक लागत प्रभावी वयस्क सुअर का रेटिना के organotypic संस्कृति के लिए तकनीक का वर्णन. संक्षेप में, एक बाँझ फिल्टर पेपर RPE और एक कस्टम बनाया एक स्टैंड द्वारा उठाए गए डालने पर जगह फोटोरिसेप्टर ऊपर की ओर से तंत्रिका रेटिना लिफ्ट बंद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
Abstract
इन विट्रो मॉडल में एक मान्यता प्राप्त के लिए मांग है कि जगह या पशु प्रयोगों को कम कर सकते हैं. सुअर रेटिना एक समान मानव रेटिना neuronal संरचना है और इसलिए मानव रेटिना चोट और अपक्षयी रोग के तंत्र के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रजाति है. यहाँ हम वयस्क सुअर का एक बूचड़खाने से प्राप्त आँखों से अलग रेटिना के organotypic संस्कृति के लिए एक लागत प्रभावी तकनीक का वर्णन. पूर्वकाल खंड को हटाने के बाद, एक trephine ब्लेड कई तंत्रिका रेटिना Bruch है वयस्क सुअर आँखों के पीछे खंड से झिल्ली RPE रंजित – श्वेतपटल explants बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. बाँझ फिल्टर पेपर के एक टुकड़े प्रत्येक explant से तंत्रिका रेटिना से लिफ्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. फिल्टर कागज रेटिना जटिल (फोटोरिसेप्टर ऊपर की ओर) एक सम्मिलित करते हैं, जो संस्कृति डिश के नीचे से दूर कस्टम बनाया एक स्टैंड द्वारा आयोजित किया गया था के ऊपर संवर्धित किया गया था. खड़े रेटिना के दोनों पक्षों के लिए संस्कृति के माध्यम से अच्छी परिसंचरण के लिए अनुमति देता है. कुल मिलाकर, यह प्रक्रिया सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और कम से कम सात दिन के लिए देशी रेटिना संरचना के संरक्षण परमिट, यह स्तनधारी रेटिना पर morphological, औषधीय, और जैव रासायनिक अध्ययन के एक किस्म के लिए एक उपयोगी मॉडल बनाने.
Protocol
Discussion
विजन शोधकर्ताओं रेटिना संस्कृति प्रणालियों की एक किस्म की स्थापना की है organotypic प्रणाली, रेटिना स्टेम सेल प्रत्यारोपण 1, रेटिना 2 उत्थान, और exogenous जीन अभिव्यक्ति 3-5 जैसे मुद्दों की एक किस्म का अध?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम NIH अनुदान 012031 EY (एट ए), एफएम Kirby फाउंडेशन (एट ए), अनुसंधान से एक पुरस्कार दृष्टिहीनता, (MAZ) इंक, न्यू जर्सी लायंस नेत्र अनुसंधान फाउंडेशन (MAZ) को रोकने के द्वारा समर्थित किया गया था, न्यू जर्सी (MAZ), यूसुफ जे और गुलबहार DiSepio रेटिना रिसर्च फंड (MAZ), जेनिस और मिशेल वासर और एश्बी मिशेल फैलोशिप (AMK) के नेत्र संस्थान.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| MEM | Invitrogen-Gibco | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman | 1004 | |
| DMEM | Cellgro-mediatech Inc | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen-Gibco | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Sciences | |||
| Cryostat | Leica | CM1900 | |
| Vibratome | Leica | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | DAKO | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
