Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi
Summary
MACS ve Annexin V-konjuge manyetik boncuk ve hedef lipid ve Annexin V-bağlayıcı fosfatidilserin sentezlenen lipid veziküller hedef lipid protein etkileşim test etmek için. Ortak hedef lipid bağlı Proteinler saflaştırılmış ve boncuk elüsyon sonra analiz edilir.
Abstract
Lipidler çoğu arıtma prosedürleri erişilemez duruma, bu nedenle hücre zarlarında gömülü ve çünkü lipid protein etkileşim analizi zordur. Alternatif olarak, lipidler, lipid ELISA ve Plazmon rezonans spektroskopi için kullanılan gibi düz yüzeyler üzerinde kaplı olabilir. Ancak, yüzey kaplama lipidler, lipid bağlayıcı özellikleri için önemli olabilir microdomain yapılar oluşturmak yok. Ayrıca, bu yöntemleri, hedef lipidler bağlayıcı proteinlerin büyük miktarlarda arıtma için izin vermez.
Lipid protein etkileşim test bu sınırlamaları aşmak ve lipid bağlayıcı proteinlerin arındırmak için manyetik aktive hücre sıralama (LIMACS) kullanarak lipid vezikül aracılı afinite kromatografisi olarak adlandırılan yeni bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemde, lipid veziküller Annexin V MACS çapa lipid olarak hedef lipid ve fosfatidilserin ile hazırlanmıştır. Fosfatidilserin protein Annexin V. fosfatidilserin içeren lipid veziküller manyetik boncuk bağlamak Annexin V konjuge manyetik boncuklar kullanarak yüksek afinite gösteren her yerde bulunan bir hücre zarı fosfolipid. Hedef lipid bağlayıcı protein, lipid veziküller lizat bir hücre ile inkübe edilir boncuklar bağlı olacak ve MACS kullanarak ortak arındırılmalıdır. Bu yöntem ayrıca test etmek için kullanılır rekombinant proteinler sulandırmak hedef lipid bağlayıcı bir protein kompleksidir.
Biz sphingolipid seramid ve co-purify prostat apoptozis cevabı 4 (PAR-4), seramid ilişkili aPKC için bağlayıcı bir protein atipik PKC (aPKC) etkileşimi göstermek için bu yöntemi kullanmıştır. Ayrıca hücre polarite ilgili proteinler Par6 ve Cdc42 rekombinant aPKC seramid ile ilişkili kompleks sulandırıldıktan için bu yöntemi kullanmıştır. Lipid veziküller sphingo-veya fosfolipitler çeşitli hazırlanmış olabilir, hücre zarından yakından benzer bir lipid ortamda LIMACS lipid-protein etkileşim için çok yönlü bir test sunuyor. Ek lipid protein kompleksleri lipid bağlayıcı protein, lipid veziküller ile birlikte arıtılmış proteomik analizi kullanılarak tespit edilebilir.
Protocol
Discussion
Hücre zarında lipid gömerek bir lipid ve bağlayıcı protein arasında belirli bir etkileşim test etmek için bir engel teşkil etmektedir. Hücre zarı, birkaç lipitleri ve proteinleri karışımından oluşur ve lipid microdomains veya sallar düzenlenmiştir. Bu nedenle, bir protein, lipid doğrudan bağlar ya da sadece bir microdomain yapısı zenginleştirilmiş microdomains ve proteinlerin ortak arıtma açıkça ayırt edemez. Lipid ELISA'larla veya Plasmon rezonans spektroskopi gibi yüzeyleri kaplanm?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe programı R01NS046835 ve R01AG034389 ve Dimes hibe 6FY08-322 Mart tarafından desteklenmiştir. MACS teknolojisi, onun bakış açısı ile muazzam yardımcı Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) için ayrılmış özel bir teşekkür ediyorum. Miltenyi cömertçe deneyler gösteri için hiçbir ücret ödemeden kullanılan malzeme sağladı. Ben de hücre hatları ifade PKCζ oluşturulan Dr. Guanghu Wang (Medical College of Georgia / Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi, Augusta, GA) minnettarım. Destek Gürcistan / Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi (Dr Lin Mei müdürlüğüne altında) Tıp College Moleküler Tıp Enstitüsü tarafından da kabul edilmektedir.
Materials
Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns were provided by Miltenyi Biotec, Inc. (Auburn, CA). All lipids were of highest purity and obtained from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).
References
- Wang, G. Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells. J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).
- Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells. J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).
- Chalfant, C. E. De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1. J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).
- Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles. Biochimie. 38, 14676-14682 (1999).
- Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. Biophysics (and sociology) of ceramides. Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).
- Kumagai, K. CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides. J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).
