तैयारी और प्रयोग करें एचआईवी 1 संक्रमित प्राथमिक + प्राकृतिक खूनी सेल साइटोटोक्सिक Assays में लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में सीडी 4 टी कोशिकाओं

Summary

Cytotoxicity assays एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं प्राकृतिक हत्यारा सेल lytic प्रतिक्रियाओं को मापने लक्ष्य कोशिकाओं की शुद्धता के द्वारा सीमित है. हम यहाँ एचआईवी -1 CD4 नीचे मिलाना करने की क्षमता का लाभ लेने के द्वारा एचआईवी -1 संक्रमित प्राथमिक टी सेल विस्फोटों के एक उच्च शुद्ध जनसंख्या के अलगाव को प्रदर्शित करता है.

Abstract

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells ^1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells ³. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments ^3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1’s ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells ^3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population ^5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes ⁸ called “cytolytic granules”. By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of ⁵¹Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Protocol

1. मानव CD4 + परिधीय रक्त से टी कोशिकाओं (चित्रा 1 देखें) के अलगाव परिधीय शिरापरक रक्त Vacutainer (40 से 60 MLS) में एकत्र किया जाता है सोडियम हेपरिन (Becton Dickenson) युक्त ट्यूबें. परिधीय रक्त फिर Vacutainer से स्थानांतरित कर रहा है 50 एमएल polystyrene शंक्वाकार ट्यूब (ट्यूब प्रति रक्त की 20 एमएल) के लिए ट्यूबें. RosetteSep सीडी 4 + टी सेल अलगाव अभिकर्मक (StemCell टेक्नोलॉजीज) 1 एक 50 मिलीलीटर ट्यूब और अच्छी तरह से मिश्रित में एमएल रक्त की कोई 20 से अधिक एमएल मात्रा में जोड़ा जाता है. मिश्रण फिर 20 मिनट के लिए 20-25 ° सी में incubated. 20 मिनट के बाद, कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त फॉस्फेट (CMF) buffered खारा [पीबीएस (HyClone] w / 2 गर्मी निष्क्रिय% (56 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए) भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS (HyClone)] में जोड़ा मिश्रण क्रम में 40 एमएल की अंतिम मात्रा को प्राप्त करने के लिए. पतला मिश्रण (30 मिलीलीटर) तो लिम्फोसाइट पृथक्करण मध्यम के 15 एमएल के शीर्ष पर स्तरित हैं [LSM (Cellgro)] ताजा 50 एमएल polystyrene शंक्वाकार ट्यूबों में. 50 एमएल ट्यूबों तो ब्रेक से 20 मिनट के लिए x 1200 छ पर centrifuged . 50 एमएल ट्यूबों अपकेंद्रित्र से हटा रहे हैं ध्यान से, ताकि LSM और मध्यम के बीच इंटरफेस परेशान नहीं है. इंटरफेस में कक्षों को एक 10 एमएल विंदुक के साथ एकत्र कर रहे हैं और ताजा 50 एमएल polystyrene शंक्वाकार ट्यूब में रखा जाता है. एकत्र इंटरफेस पीबीएस / 2 w% FBS के साथ 50 एमएल की अंतिम मात्रा को पतला कर रहे हैं. पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 50 एमएल पतला इंटरफेस युक्त ट्यूबों x 1200 छ पर centrifuged हैं. Centrifugation के बाद, supernatants से aspirated और छर्रों पीबीएस w के 10 MLS / 2% FBS में resuspended. सेल निलंबन तो एक एकल 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में संयुक्त रहे हैं और 50 MLS पीबीएस w / 2% FBS के साथ पतला. संयुक्त सेल निलंबन युक्त ट्यूब x 300 ग्राम पर 10 मिनट के लिए centrifuged है शेष सभी LSM हटायें. सतह पर तैरनेवाला से aspirated है और गोली तो RPMI-1640 मध्यम के 10 MLS (HyClone) में resuspended FBS 10%, 100 यू / पेनिसिलिन के मिलीलीटर, 100 मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन मिलीलीटर (HyClone) और 2 मिमी एल glutamine (CellGro युक्त ) (RPMI पूर्ण) और एक hemocytometer का उपयोग गिना. सीडी 4 + टी कोशिकाओं को शुद्ध करने की एकाग्रता तो 3×10 6 RPMI पूरी तरह से एमएल / निकाला जाता है. सीडी 4 + 'एस तो उन्हें 72 घंटे के लिए एक तीन सेल अनुपात प्रति 37 ° मोती सी में एक 5% C0 2 humidified पर [टी सेल विस्तार किट (Miltenyi बायोटेक)] मोती मिलकर anti-CD3/anti-CD28 साथ संवर्धन द्वारा प्रेरित कर रहे हैं इनक्यूबेटर. 2. सीडी 4 + एचआईवी -1 के साथ टी कोशिकाओं (चित्रा 1 देखें) के संक्रमण सेल प्रेरित सीडी 4 + टी कोशिकाओं से युक्त निलंबन संस्कृति की थाली से हटा रहे हैं और एक hemocytometer गिनती का उपयोग. + CD4 टी कोशिकाओं (~ 6 2×10) एक 15 एमएल एक असंक्रमित नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए शंक्वाकार ट्यूब करने के लिए जोड़ रहे हैं. सीडी 4 का शेष + टी सेल निलंबन एक 50 एमएल संक्रमण के लिए शंक्वाकार ट्यूब में रखा गया है. सीडी 4 + टी सेल निलंबन x 300 ग्राम पर 10 मिनट और संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के लिए centrifuged युक्त ट्यूब से aspirated है . प्रेरित सीडी 4 + टी कोशिकाओं को सीधे संस्कृति virions युक्त तरल पदार्थ में resuspended हैं और फिर 20-25 ° 9 सी 1200 2 घंटे के लिए एक्स जी में स्पिन संक्रमित . आमतौर पर हम एक प्रतिकृति की कमी एचआईवी (जैसे, DHIV-3) तनाव या एक प्रतिकृति सक्षम वायरस के लिए एक MOI 0.01 के संक्रमण के एक 5 के (MOI) बहुलता + CD4 टी कोशिकाओं को संक्रमित (जैसे, एचआईवी – 1 / 3 NL4 ) . अंतिम मात्रा महत्वहीन है लेकिन ट्यूबों centrifugation के लिए संतुलित होना चाहिए. Polybrene (सांताक्रूज) संस्कृति तरल पदार्थ में जोड़ा है 10 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में spinfection से पहले. Spinfection के पूरा होने पर, supernatants हटा रहे हैं और कोशिकाओं 6 / 3×10 एमएल के RPMI पूरा सेल घनत्व में 100 यू / एमएल आईएल-2 के साथ पूरक में resuspended. संक्रमित और uninfected कोशिकाओं को 72 घंटे के लिए संस्कृति कर रहे हैं अगर एक प्रतिकृति अक्षम वायरस कक्ष या 5-7 दिनों अगर एक प्रतिकृति सक्षम वायरस कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था संक्रमित किया गया था. मीडिया संस्कृति के दौरान हर 48 घंटे में बदल जाना चाहिए. 3. परिधीय रक्त से मानव प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के अलगाव परिधीय शिरापरक रक्त (~ 100 मिलीलीटर) एक ही Vacutainer में सीडी 4 + टी कोशिकाओं को अलग किया दाता से एकत्र किया जाता है सोडियम हेपरिन (Becton Dickenson) युक्त ट्यूबें. रक्त फिर Vacutainer से स्थानांतरित कर रहा है 20 एमएल aliquots में 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ट्यूब. Vacutainer ट्यूब तो सीएमएफ हैंक्स बैलेंस्ड नमक समाधान [HBSS (Hyclone)] 8 एमएल के साथ धो रहे हैं और washes 50 एमएल conicals containi को हस्तांतरित कर रहे हैंपरिधीय रक्त के 20 एमएल एनजी. प्रत्येक 50 एमएल शंक्वाकार में जिसके परिणामस्वरूप की मात्रा 35 एमएल है. पतला खून तो एक ताजा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में LSM के 15 एमएल और ब्रेक से 30 मिनट के लिए 400 x जी पर centrifuged ट्यूबों के शीर्ष पर स्तरित है . ट्यूबों अपकेंद्रित्र से ध्यान हटा रहे हैं और LSM और मध्यम के बीच परिणामस्वरूप इंटरफ़ेस प्रत्येक एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग ट्यूब से काटा जाता है और ताजा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में रखा गया है. सेल निलंबन एक बार सीएमएफ HBSS (पर ब्रेक के साथ 15 मिनट के लिए 400 एक्स जी पर centrifuged) के साथ धो रहे हैं. धोने के बाद पहली supernatants हटा दिया है और जिसके परिणामस्वरूप छर्रों संयुक्त कर रहे हैं और एक एकल 50 शंक्वाकार एमएल में सीएमएफ HBSS (x 30 ग्राम पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए centrifuged) के साथ दो बार धोया के लिए सभी शेष LSM हटायें. धोने के बाद पिछले गोली ACK lysis बफर के 10 एमएल में resupended (150 राष्ट्रीय राजमार्ग 4 सीएल मिमी 1.0 मिमी 3 KHCO और 0.1 मिमी EDTA पीएच 7.3) और 5 मिनट के लिए कमरे Temp (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर incubated . यह चरण आवश्यक है क्रम में करने के लिए परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) से contaminating एरिथ्रोसाइट्स हटायें है. के बाद 10 मिनट. सीएमएफ पीबीएस के 40 एमएल सेल निलंबन के लिए जोड़ा जाता है क्रम में lysis प्रतिक्रिया को रोकने के. तब सेल PBMC और lysed एरिथ्रोसाइट्स युक्त निलंबन के साथ ट्यूब पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए x 300 ग्राम पर centrifuged. सतह पर तैरनेवाला निकाल दिया है और गोली पीबीएस के 5 एमएल में 2% FBS और 2 मिमी EDTA और एक hemocytometer गिनती का उपयोग के साथ resuspended है. प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के.) तो PBMC [नकारात्मक चयन मानव (Miltenyi बायोटेक)] निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार एक एन.के. सेल अलगाव किट का उपयोग कर से अलग कर रहे हैं. स्तंभों से के माध्यम से प्रवाह 15ml ट्यूबों में एकत्र कर रहे हैं और ट्यूब पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 300 x छ centrifuged हैं. supernatants हटा रहे हैं और छर्रों resuspended. एक ट्यूब में resuspended छर्रों है Iscove संशोधित है Dulbecco मध्यम [IMDM (Gibco)] के 1 एमएल के एक कुल मात्रा में संयुक्त रहे हैं 10% एबी + निष्क्रिय गर्मी (56 ° 30 मिनट के लिए सी) मानव सीरम (एचएस) के साथ पूरक और एक साथ गिना hemacytometer. सेल निलंबन की मात्रा IMDM w/10% एच एस के साथ निकाला जाता है ताकि अंतिम एन.के. कोशिकाओं के घनत्व 3×10 6 / एमएल है . सेल निलंबन आधे में विभाजित है. एन.के. कोशिकाओं का एक सेट 200 / पुनः संयोजक मानव इंटरल्यूकिन-2 यू एमएल प्राप्त करता है. कोशिकाओं के अन्य सेट मध्यम में cytokine उपचार के बिना छोड़ दिया है. एन.के. सेल संस्कृतियों तो 37 2 ° 5 सी,% सीओ पर रातोंरात incubated हैं परिणामस्वरूप एन.के. कोशिकाओं तो एक CD107a degranulation परख या 51 करोड़ रिलीज परख को या तो के लिए effector कोशिकाओं के रूप में उपयोग किया जाता है. 4. एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं के शोधन (चित्रा 1 देखें) संस्कृति संक्रमित कोशिकाओं से युक्त तरल पदार्थ प्लेटों से हटा रहे हैं और पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 300 x छ centrifuged. सतह पर तैरनेवाला से aspirated और छर्रों पीबीएस के 2 एमएल में 2% FBS और 2 मिमी EDTA कोशिकाओं और एक hemocytometer पर गिना के साथ resuspended हैं. संक्रमित कोशिकाओं है कि एचआईवी -1 शामिल नहीं है कि लोगों को वायरस बंदरगाह से दूर तथ्य यह है कि एचआईवी -1 CD4 नीचे modulates के लाभ लेने के द्वारा अलग कर रहे हैं. इस उद्देश्य के CD4 के लिए सकारात्मक अलगाव किट (Invitrogen) निर्माताओं और निर्देश है कि अपवाद के साथ एक सेल अनुपात प्रति मनका एक सीडी 4 का प्रयोग किया जाता है के अनुसार किया जाता है. सीडी 4 + टी कोशिकाओं को हटाने पर, मृत कोशिकाओं को शुद्ध सेल निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार एक मृत सेल हटाना किट (Miltenyi बायोटेक) का उपयोग कर वायरस शरण जनसंख्या से हटा रहे हैं. स्तंभों में मृत सेल को हटाने के बाद के माध्यम से प्रवाह पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 300 x छ centrifuged है. सतह पर तैरनेवाला निकाल दिया जाता है, छर्रों 1 एमएल RPMI पूरा resuspended और कोशिकाओं गिना जाता है. शुद्ध संक्रमित कोशिकाओं अब CD107a degranulation परख या 51 करोड़ रिलीज परख में लक्ष्य के रूप में उपयोग करने के लिए तैयार हैं. 5. CD107a Degranulation परख (देखें चित्र 2) एन.के. सेल संस्कृतियों प्लेटों से हटा रहे हैं और सेल निलंबन में गिना जाता है. एन.के. सेल निलंबन पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 300 x छ centrifuged हैं. एन.के. कोशिकाओं RPMI पूरा resuspended कर रहे हैं और अंतिम एकाग्रता 10 6 कोशिकाओं / एमएल के लिए समायोजित. पृथक संक्रमित और uninfected उपरोक्त चरणों में उत्पन्न टी कोशिकाओं से सेल निलंबन पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 300 x छ centrifuged हैं. Supernatants हटा रहे हैं और छर्रों 2×10 6 कोशिकाओं / एमएल RPMI पूरा resuspended. K562 कोशिकाओं सकारात्मक नियंत्रण लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में उपयोग किया जाता है, के रूप में वे अत्यधिक एन.के. lysis के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. टीवह कोशिकाओं x 300 ग्राम पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए centrifuged हैं, supernatants हटा दिया है और छर्रों resuspended 2×10 6 कोशिकाओं / एमएल RPMI पूरा में एक 96-V तली अच्छी तरह से थाली 100 MCL लक्ष्य और 100 MCL effectors के कुओं को जोड़ रहे हैं. एक अच्छी तरह से लक्ष्य कोशिकाओं के बिना 100 mcLof effectors और MCL के 100 मध्यम युक्त गैर विशिष्ट एन.के. सेल degranulation के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. प्रत्येक अच्छी तरह से 10 mcLFITC संयुग्मित विरोधी CD107a (BDIS) जोड़ा जाता है. थाली पर ब्रेक के साथ 2 मिनट के लिए तो x 20 ग्राम पर centrifuged . centrifuged थाली 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में incubated है. ऊष्मायन के बाद थाली पर ब्रेक के साथ 5 मिनट के लिए 400 x जी पर centrifuged है. सतह पर तैरनेवाला गोली से निकाल दिया जाता है. हर अच्छी तरह से तो 100 mcLof प्रवाह बफर (पीबीएस w / 2% FBS और 0.1% 3 NaN) के कुल में 20 मिनट के लिए बर्फ पर fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के निम्न पैनल के साथ दाग anti-CD3/14/20 [प्रशांत ब्लू संयुग्मित (Biolegend)] विरोधी CD56 [APC (Biolegend)] 20 मिनट ऊष्मायन के बाद, 200 MCL प्रवाह बफर के प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा जाता है और थाली पर ब्रेक के साथ 5 मिनट के लिए 400 x जी पर centrifuged है. प्रवाह बफर तो ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से एक 2 एमएल aspirating एक 200 MCL micropipet टिप के साथ लगे जबकि गोली को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करने के pipet का उपयोग कर से aspirated. चरण 15 और 16 एक बार और दोहराया कर रहे हैं. हिमपात सीएमएफ पीबीएस में 1% paraformaldehyde की 200 MCL में resuspended हैं. सेल निलंबन तो प्रवाह ट्यूबों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. कुल मात्रा MCL 300 सीएमएफ पीबीएस में 1% paraformaldehyde की ~ 100 MCL प्रत्येक ट्यूब को जोड़ने के द्वारा लाया जाता है. घटनाओं (4 2×10) एन.के. कोशिकाओं को इसी FACS DIVA (BDIS) के अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर और फ्लो जो सॉफ्टवेयर (TreeStar) का उपयोग करते हुए विश्लेषण का उपयोग कर एक प्रवाह cytometer द्वारा एकत्र कर रहे हैं. 6. CD107a Gating रणनीति (चित्रा 3 देखें) सिंगल सेल द्वार आगे तितर बितर (FSC – एच) ऊंचाई बनाम आगे तितर बितर (FSC डब्ल्यू) चौड़ाई साजिश का उपयोग कर बनाई गई हैं. आकार बनाम granularity की साजिश के लिए एक FSC बनाम ओर तितर बितर साजिश (एसएससी) एकल कक्ष के गेट पर बनाया है. आमतौर पर लिम्फोसाइटों अपेक्षाकृत कम विघटन और मध्यम कोशिका का आकार है. लिम्फोसाइट गेट में कोशिकाओं तो CD3/14/20 एन.के. कोशिकाओं पर दाग बनाम कोशिकाओं CD56 गेट दाग कोशिकाओं की बिंदी साजिश में प्लॉट किए जाते हैं जबकि (CD14) monocytes, टी कोशिकाओं (CD3) और बी कोशिकाओं omitting ( CD20). CD56 स्थिति gated जनसंख्या तो CD107a के लिए मूल्यांकन किया जाता है. लक्ष्य समूह के बिना एन.के. कोशिकाओं क्या CD107a नकारात्मक माना जाता है के लिए फाटकों को सेट करने के लिए प्रयोग किया जाता है. 7. 51 करोड़ रिलीज परख (चित्र 4 देखें) संक्रमित कोशिकाओं लक्ष्य 125 mcCi 51 करोड़ (Perkin एल्मर) के साथ 2 बजे के लिए saline/10 6 कोशिकाओं में चिह्नित कर रहे हैं 37 पर 500 MCL के कुल में डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. McCi 100 करोड़ 51 के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 10 6 K562 कोशिकाओं 2 बजे के लिए चिह्नित कर रहे हैं 37 पर 500 MCL के कुल में डिग्री सेल्सियस और 5 % सीओ 2. कुल मात्रा के साथ 500 MCL RPMI पूरा लाया जाता है. यहाँ 51 करोड़ लक्ष्य कोशिकाओं के लिए जोड़ी की मात्रा की गणना की जाती है: (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator) जबकि लक्ष्य कोशिकाओं लेबलिंग रहे हैं, पहले से पृथक एन.के. कोशिकाओं संस्कृति से हटा रहे हैं और गिना. एन.के. कोशिकाओं से युक्त सेल संस्कृतियों पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 300 x छ centrifuged हैं. एन.के. कोशिकाओं से युक्त हिमपात RPMI पूरा resuspended कर रहे हैं और 3 ट्यूबों में विभाजित है. सेल घनत्व एक ट्यूब, 2.5×10 दूसरी ट्यूब में 5 मिलीग्राम / और 5×10 तीसरे ट्यूब में 5 एमएल / 10 5 एमएल / निकाला जाता है. लेबल लक्ष्य कोशिकाओं इनक्यूबेटर से हटा रहे हैं और 4.5 RPMI पूरा एमएल प्रत्येक ट्यूब करने के लिए जोड़ा जाता है. ट्यूबें तो 300 x gf या 10 मिनट पर centrifuged हैं. सतह पर तैरनेवाला सावधानी के रूप में रेडियोधर्मी तरल अपशिष्ट के लिए एक कंटेनर में गोली को परेशान करने के लिए बंद कर डाला है. चरण 4 और 5 में दो बार दोहराया जाता है सभी अनवशोषित 51 करोड़ हटायें. गैर रेडियोधर्मी तरल कचरे के लिए एक कंटेनर में तीसरे धोने से Supernatants का निपटारा किया जा सकता है. लेबल लक्ष्य तो 5 एमएल / 10 के अंतिम सेल घनत्व RPMI पूरा resuspended. 100 MCL लेबल लक्ष्य के कुओं में 96 v नीचे 10 4 लक्ष्य कोशिकाओं के अंतिम सेल / अच्छी तरह से संख्या के लिए अच्छी तरह से थाली के aliquoted हैं . Table1 एक 51 करोड़ रिलीज परख के लिए एक ठेठ सेटअप का एक उदाहरण है . प्रत्येक समूह में तीन प्रतियों में किया जाता है. 1 2 <tघ> 3 4 5 6 7 8 9 एक K562 ई: टी (01:01) K562 ई: टी (01:01) K562 ई: टी (01:01) K562 ई: टी (2.5:1) K562 ई: टी (2.5:1) K562 ई: टी (2.5:1) K562 ई: टी (05:01) K562 ई: टी (05:01) K562 ई: टी (05:01) बी यूआई ई: टी (01:01) यूआई ई: टी (01:01) यूआई ई: टी (01:01) यूआई ई: टी (2.5:1) यूआई ई: टी (2.5:1) यूआई ई: टी (2.5:1) यूआई ई: टी (05:01) यूआई ई: टी (05:01) यूआई ई: टी (05:01) सी एचआईवी -1 संक्रमित ई: टी (01:01) एचआईवी -1 संक्रमित ई: टी (01:01) एचआईवी -1 संक्रमित ई: टी (01:01) एचआईवी -1 संक्रमित ई: टी (2.5:1) एचआईवी -1 संक्रमित ई: टी (2.5:1) एचआईवी -1 संक्रमित ई: टी (2.5:1) एचआईवी -1 संक्रमित ई: टी (01:01) एचआईवी -1 संक्रमित ई: टी (01:01) एचआईवी -1 संक्रमित ई: टी (01:01) डी ई एफ K562 स्वतःस्फूर्त रिलीज K562 स्वतःस्फूर्त रिलीज K562 स्वतःस्फूर्त रिलीज यूआई स्वतःस्फूर्त रिलीज यूआई स्वतःस्फूर्त रिलीज यूआई स्वतःस्फूर्त रिलीज एचआईवी -1 संक्रमित स्वतःस्फूर्त रिलीज एचआईवी -1 संक्रमित स्वतःस्फूर्त रिलीज एचआईवी -1 संक्रमित स्वतःस्फूर्त रिलीज जी K562 अधिकतम रिलीज K562 अधिकतम रिलीज K562 अधिकतम रिलीज यूआई अधिकतम रिलीज़ यूआई अधिकतम रिलीज़ यूआई अधिकतम रिलीज़ एचआईवी -1 संक्रमित Maxmum रिलीज एचआईवी -1 संक्रमित Maxmum रिलीज एचआईवी -1 संक्रमित Maxmum रिलीज ऊपर एन.के. सेल निलंबन के 100 MCL प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त लक्ष्य कोशिकाओं को जोड़ रहे हैं. 100 लक्ष्य के MCL इसी कुओं जिसमें effector कोशिकाओं को अधिकतम और सहज रिलीज समूहों के लिए अनुपस्थित रहे हैं करने के लिए जोड़ रहे हैं. सहज रिलीज समूह RPMI पूरा एक अतिरिक्त 100 MCL के साथ incubated है. पर ब्रेक के साथ 2 मिनट के लिए अच्छी तरह से थाली 96 x 20 ग्राम पर centrifuged है. centrifuged थाली तो 37 में incubated है डिग्री सेल्सियस और 5% 4 घंटे के लिए सीओ 2. 4 घंटे ऊष्मायन 5 RPMI पूरा में एक मानव लाल रक्त कोशिकाओं के 1:10 कमजोर पड़ने के एमसीएल के बाद अधिकतम रिलीज कुओं को छोड़कर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा जाता है. 100 MCL के 10% सोडियम dodecyl सल्फेट अधिकतम रिलीज कुओं के लिए जोड़ा जाता है. प्लेट 400 x जी पर गोली कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के लिए centrifuged है. 100 MCL के सेल – मुक्त सतह पर तैरनेवाला एक अच्छी तरह से काटा जाता है और अलग गामा-काउंटर ट्यूबों (Perkin एल्मर) में रखा गया है . ट्यूबों 2470 स्वचालित गामा काउंटर (Perkin एल्मर) में रखा जाता है. संस्कृति द्रव में 51 करोड़ वर्तमान की राशि प्रति मिनट एक 2 मिनट पढ़ने के औसत से मायने रखता है के रूप में मापा जाता है. नमूने और नियंत्रण गिनता है (सीपीएम) प्रति मिनट की रीडिंग के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करके% विशिष्ट lysis की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है: [(प्रयोगात्मक सीपीएम – सहज सीपीएम का मतलब) / (अधिकतम CPM का मतलब – सहज सीपीएम मतलब)] x 100 8. प्रतिनिधि परिणाम: चित्रा 1. प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के अलगाव में शामिल चरण और पीढ़ी एचआईवी 1 परिधीय रक्त से संक्रमित लक्ष्य कोशिकाओं. चित्रा 2. CD107a degranulation effectors और K562 कोशिकाओं, असंक्रमित सीडी 4 + टी कोशिकाओं और एचआईवी -1 लक्ष्य के रूप में टी कोशिकाओं को संक्रमित के रूप में एन.के. कोशिकाओं का उपयोग परख के निर्माण में शामिल कदम. चित्रा 3. फ्लो CD107a degranulation परख के लिए cytometry gating रणनीति (ए) के एक भूखंड पर एकल और कोशिकाओं को छोड़कर clumps या दोहरी पर Gating FSC-A (आगे तितर बितर क्षेत्र) FSC – एच बनाम (आगे तितर बितर ऊंचाई). (बी) सिंगल सेल फाटक FSC-लिम्फोसाइट आबादी पर एक बनाम एसएससी gating (पक्ष स्कैटर) के रूप में प्लॉट किए जाते हैं. (सी) लिम्फोसाइट गेट CD3/14/20 के रूप में प्लॉट किए जाते हैं(टी कोशिकाओं, monocytes, बी कोशिकाओं) CD56 बनाम (एन.के. कोशिकाओं) CD56 स्थिति andCD3/14/20 neg जनसंख्या (एन.के. गेट) पर gating. (डी) एन.के. गेट CD107a बनाम CD56 के रूप में प्लॉट किए जाते हैं एन.के. कोशिकाओं है कि (CD107a स्थिति) degranulated कल्पना . चित्रा 4. 51 करोड़ रिलीज effectors और K562 कोशिकाओं, असंक्रमित सीडी 4 + टी कोशिकाओं और एचआईवी -1 लक्ष्य के रूप में टी कोशिकाओं को संक्रमित के रूप में एन.के. कोशिकाओं का उपयोग परख के निर्माण में शामिल कदम. चित्रा 5. के खिलाफ प्राकृतिक हत्यारा साइटोटोक्सिक प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए प्रतिनिधि के परिणाम एचआईवी 1 संक्रमित कोशिकाओं (ए) एन.के. कोशिकाओं उनके लिए लक्ष्य के बिना और K562 कोशिकाओं के जवाब में degranulate करने की क्षमता के लिए मूल्यांकन किया गया, प्राथमिक सीडी 4 + टी कोशिकाओं और एचआईवी संक्रमित प्राथमिक टी कोशिकाओं के रूप में है कि व्यक्त की सतह CD107a एन.के. कोशिकाओं के प्रतिशत के आधार पर मूल्यांकन. प्रत्येक चक्र में संख्या कुल एन.के. कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं. टी): बी) एन.के. कोशिकाओं उनके अलग effector कोशिका में एक 51 करोड़ रिलीज परख में K562 कोशिकाओं, असंक्रमित सीडी 4 + टी सेल और एचआईवी-1 टी कोशिकाओं संक्रमित कक्ष अनुपात (ई लक्ष्य lyse करने की क्षमता के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं.

Discussion

जब सही ढंग से किया इस प्रोटोकॉल में वर्णित assays एन.के. कोशिकाओं के खिलाफ degranulate और एचआईवी -1 संक्रमित कोशिकाओं (देखें चित्र 5) lyse करने की क्षमता का एक प्रतिनिधि चित्र प्रदान करना चाहिए. एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं और एन.के. कोशिकाओं lysis एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं के जवाब में एन.के. सेल degranulation सीधे ¹⁰ आनुपातिक होना चाहिए. दो एन.के. सेल कार्यात्मक एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए assays के लिए विश्वसनीय परिणाम अत्यधिक एन.के. के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संक्रमित कोशिकाओं के एक उच्च शुद्ध जनसंख्या कोशिकाओं को शुद्ध करने के अलगाव पर निर्भर हैं. एन.के. कोशिकाओं और एचआईवी 1 संक्रमित कोशिकाओं के एक काफी सटीक सेल अनुपात लक्ष्य effector की उपलब्धि के लिए महत्वपूर्ण हैं. शुद्ध होने इसी तरह, लक्ष्य सेल आबादी से मर चुका है और apoptotic कोशिकाओं को हटाने से ^पहले 51 करोड़ या effector कोशिकाओं के साथ लेबलिंग ऊष्मायन महत्वपूर्ण ^है 51 करोड़ कोशिकाओं है कि आइसोटोप लेबलिंग कदम के दौरान मृत या apoptotic कोशिकाओं की उपस्थिति के रूप में apoptosis के दौर से गुजर रहे हैं द्वारा भली भाँति हो सकता है. एक उच्च सहज रिलीज में परिणाम और गणना% विशिष्ट lysis बिगाड़ना जाएगा. इसके अलावा, मृत या apoptotic कोशिकाओं की उपस्थिति एन.के. सेल CD107a अभिव्यक्ति के असामान्य रूप से उच्च स्तर में जिसके परिणामस्वरूप degranulation ट्रिगर हो सकता है. सटीक pipetting आवश्यक है जब ⁵¹ करोड़ रिलीज assays में एन.के. कोशिकाओं और लक्ष्य कोशिकाओं के ऊष्मायन के बाद सेल मुक्त supernatants हटाने प्रत्येक को दोहराने के से हटा सतह पर तैरनेवाला की मात्रा में अंतर के रूप में अच्छी तरह से उच्च मानक विचलन में परिणाम देगा. संशोधन इन प्रोटोकॉल के लिए बनाया जा सकता है effectors या लक्ष्य से पहले विशिष्ट रिसेप्टर्स ^या 6,11 ligands विरोधी एंटीबॉडी के साथ सह संस्कृति incubating द्वारा एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं के एन.के. कोशिकाओं lysis को ट्रिगर में विशिष्ट एन.के. रिसेप्टर्स की भूमिका का मूल्यांकन. Cytokine का इलाज एन.के. कोशिकाओं (जैसे, आईएल-2, आईएल 15) उत्तेजित एन.के. ¹² कोशिकाओं की कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसी तरह, एंटीबॉडी निर्भर सेल cytotoxicity assays इन प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है. एंटी एचआईवी एंटीबॉडी (जैसे, विरोधी gp120) एन.के. सेल कम आत्मीयता एफसी रिसेप्टर ¹³ CD16 द्वारा मान्यता के लिए लक्ष्य कक्षों के लिए जोड़ा जा सकता है . इन assays, हालांकि स्थापित करने के लिए एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं एन.के. सेल साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाओं को मापने, यह भी एन.के. कोशिकाओं की क्षमता एचआईवी संक्रमित कोशिका की मान्यता के बाद साइटोकिन्स उत्पादन उपाय करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. हालांकि हम इस प्रोटोकॉल में वर्णित इन विट्रो संक्रमित कोशिकाओं में लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में उपयोग हम हाल ही में एचआईवी से संक्रमित रोगियों से लक्ष्य कोशिकाओं की पीढ़ी का वर्णन किया है. यह सीडी 4 + टी कोशिकाओं कोशिकाओं के विस्तार के द्वारा पीछा किया एक दो सप्ताह की अवधि ^में 11 इंटरल्यूकिन -2 की उपस्थिति में mitogens साथ उत्तेजना के बाद के अलगाव की आवश्यकता है. दो सप्ताह की अवधि के विस्तार के बाद, इस अनुच्छेद में वर्णित प्रोटोकॉल लक्ष्य कोशिकाओं को अलग किया जाता है.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin)		Becton Dickenson	367874
RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit		StemCell Technologies	15062
CMF PBS		Hyclone	SH30256.01
FBS		Hyclone	10437-028
Lymphocyte Separation Medium		Cellgro	25-072-CV
RPMI-1640		Hyclone	SH30096.01
Penicillin / Streptomycin		Hyclone	SV30010
L-glutamine		Cellgro	25-005-Cl
T-cell Expansion Kit		Miltenyi Biotec	130-091-441
CMF HBSS (1x)		Hyclone	SH30588.01
0.5M EDTA			46-034-Cl
NK Cell Negative Isolation Kit		Miltenyi Biotec	130-092-657
IMDM		Gibco	12440-046
CD4+ Positive Isolation Kit		Invitrogen	113.31D
Dead Cell Removal Kit		Miltenyi Biotec	130-090-101
Polybrene		Santa Cruz	sc-134220
CD3 PacificBlue		Becton Dickenson	558117
CD14 PacificBlue		Biolegend	325616
CD20 PacificBlue		Biolegend	302328
CD56 APC		Biolegend	318310
CD69 PE		Becton Dickenson	555531
CD107a FITC		Becton Dickenson	555800
51Chromium		Perkin Elmer	NEZ030002MC
Gamma Counter Tubes		Perkin Elmer	1270-401
2470 Automatic Gamma Counter		Perkin Elmer	2470-0050
FACS Diva		Beckton Dickenson	643629
FlowJo		TreeStar	FJ-9-1YR