Immunocytochemie: menselijke neurale stamcellen

Summary

Immunocytochemie is een krachtige methode om de aanwezigheid, subcellulaire lokalisatie, en relatieve rijkdom van een antigeen van belang in gekweekte cellen te bepalen. Dit protocol biedt een makkelijk te volgen serie van stappen die in staat zal stellen een om antistoffen te behouden en het meeste uit je vlekken krijgen.

Abstract

Immunocytochemie is een zeer krachtige en vrij eenvoudige methode voor het bepalen van de aanwezigheid, subcellulaire lokalisatie, en relatieve rijkdom van een antigeen van belang, meestal een eiwit, in gekweekte cellen. Dit protocol biedt een makkelijk te volgen reeks van stappen die in staat zal stellen onderzoekers aan primaire en secundaire antilichamen te besparen, terwijl het krijgen van hoge kwaliteit, reproduceerbare kwalitatieve en kwantitatieve gegevens uit hun vlekken. Er zijn twee aspecten van dit protocol die helpen om het volume van antilichaam nodig voor kleuring behouden. Voor een, zijn de cellen gekweekt op kleine, ronde dekglaasjes die zijn geplaatst in putjes van een weefselkweek plaat. Na fixatie, kunnen de cellen op de dekglaasjes verwijderd worden uit de putjes van de plaat. Voor antilichaam kleuring, is het dekglaasje met cellen omgekeerd op een kleine daling van antilichamen oplossing op parafilm en is bedekt met een tweede stuk van Parafilm om uitdroging te voorkomen. Met behulp van deze methode is slechts ~ 25 ui van antilichaam-oplossing die nodig is voor elke dekglaasje (of monster), te worden gemerkt. Dit protocol beschrijft immunokleuring van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), maar kan worden gebruikt voor vele andere celtypes.

Protocol

Dag 1: Voorbereiding van de Duitse dekglaasjes en zaaien Cellen Let op: Duitse dekglaasjes worden vaak voorkeur voor het kweken van primaire neurale stamcellen en neuronen. We gebruiken de volgende schoonmaak protocol om celadhesie en de verspreiding te verbeteren. Positie coverslips in een klein rek dat vloeibare toegang tot beide zijden van het dekglaasje zal toestaan. De eerste, incubeer dekglaasjes in 1% Liquinox gedurende 10 minuten, gevolgd door drie wasbeurten met gedemineralis…

Discussion

Dit protocol beschrijft een procedure voor immunokleuring hNSPCs dat het volume van antilichamen nodig minimaliseert en geeft betrouwbare cel vlekken. De procedure zoals beschreven is het beste voor intracellulaire antigenen, maar kan worden aangepast aan het celoppervlak moleculen vlek of vlekken van het cytoskelet te verbeteren.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological Supply Company	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson Immunoresearch	001-000-161
Hoechst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous