Иммуноцитохимическая: Человеческие нервные стволовые клетки
Summary
Иммуноцитохимическая представляет собой мощный метод для определения присутствия, субклеточные локализации, а также относительное содержание антигена интереса к культуре клеток. Этот протокол представляет простой в последующей серии шагов, которые позволяют сохранить антител и получить максимальную отдачу от своих пятен.
Abstract
Иммуноцитохимическая это очень мощный и достаточно простой метод для определения присутствия, субклеточные локализации, а также относительное содержание антигена интересов, чаще всего белка в культуре клеток. Этот протокол представляет простой в последующей серии шагов, что позволит исследователям сохранить первичные и вторичные антитела, получая высокое качество, воспроизводимые качественных и количественных данных из их окрашивания. Есть два аспекта этого протокола, который поможет сохранить объемы антитела необходимы для окрашивания. С одной стороны, клетки выращивают на небольших, круговые покровные, которые размещаются в лунках планшета для культуры ткани. После фиксации клеток на покровных могут быть удалены из скважин пластины. Для окрашивания антителами, покровное с клетками инвертируется на небольшую каплю раствора антител на парафильмом и покрыт второй кусок парафильмом для предотвращения высыхания. Используя этот метод, только ~ 25 мкл антител решения, необходимые для каждого покровное (или образец), чтобы быть окрашены. Этот протокол описывает иммуноокрашивания из человеческих стволовых нейронных / клеток-предшественников (hNSPCs), но может использоваться и для многих других типов клеток.
Protocol
Discussion
Этот протокол описывает процедуру иммуноокрашивания hNSPCs, что сводит к минимуму объем антител необходимо и дает надежные окрашивания клеток. Процедура, как описано, что лучше для внутриклеточных антигенов, но может быть изменен, чтобы пятно молекул клеточной поверхности, а также для усиления окра…
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность д-р Филип Х. Шварца о человеческом нейронных ресурсов стволовых клеток в детской больнице, Orange County научно-исследовательский институт для обеспечения hNSPC культур и доктор Гари Bassell в Университете Эмори для начального обучения в технике окрашивания парафильмом.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips | Tool | Carolina Biological Supply Company | WW-63-3029 | 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available |
| Liquinox phosphate-free detergent | Reagent | Sigma | Z273279 | very viscous |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P7280 | |
| Laminin, natural mouse | Reagent | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| 24 well plate | Tool | Fisher | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Reagent | Fisher | BP151-500 | very viscous |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma | P6148 | potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form |
| Bovine Serum Albumin, IgG-free | Reagent | Jackson Immunoresearch | 001-000-161 | |
| Hoechst 33342 | Reagent | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Reagent | Vector Laboratories | H-1000 | viscous |
References
- Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Immunocytochemical analysis of stem cells. In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
