Immunocytochimie: des cellules souches humaines

Summary

Immunocytochimie est une méthode puissante pour déterminer la présence, la localisation subcellulaire, et l'abondance relative d'un antigène d'intérêt dans les cellules cultivées. Ce protocole présente un outil facile à suivre la série d'étapes qui permettent de conserver les anticorps et tirer le meilleur parti de sa coloration.

Abstract

Immunocytochimie est une méthode très puissante et assez simple pour déterminer la présence, la localisation subcellulaire, et l'abondance relative d'un antigène d'intérêt, le plus souvent une protéine, dans les cellules cultivées. Ce protocole présente un outil facile à suivre la série de mesures qui permettront aux chercheurs de conserver les anticorps primaires et secondaires tout en obtenant de haute qualité, reproductibles et qualitative des données quantitatives de leur coloration. Il ya deux aspects de ce protocole qui aidera à conserver le volume d'anticorps nécessaire pour la coloration. D'une part, les cellules sont cultivées sur de petites lamelles circulaires qui sont placés dans les puits d'une plaque de culture de tissus. Après fixation, les cellules sur des lamelles peuvent être retirés dans les puits de la plaque. Pour la coloration des anticorps, la lamelle avec des cellules est inversée sur une petite goutte de solution d'anticorps sur parafilm et est recouvert d'un second morceau de parafilm pour éviter le dessèchement. En utilisant cette méthode, seulement ~ 25 pl de solution d'anticorps est nécessaire pour chaque lamelle (ou échantillons) doivent être colorées. Ce protocole décrit immunomarquage des souches neurales humaines / cellules précurseurs (hNSPCs), mais peut être utilisé pour de nombreux autres types cellulaires.

Protocol

Jour 1: Préparation des lamelles en verre Cellules allemande et l'ensemencement Remarque: des lamelles de verre allemands sont souvent préférable pour la culture primaire des cellules souches neurales et les neurones. Nous utilisons le protocole de nettoyage suivantes pour améliorer l'adhérence des cellules et se propager. Position des lamelles dans un rack petits qui permettra l'accès de liquide aux deux côtés de la lamelle. Tout d'abord, des lamelles incuber …

Discussion

Ce protocole décrit une procédure d'immunomarquage hNSPCs qui minimise la quantité d'anticorps nécessaire et donne une coloration cellulaire fiable. La procédure décrite est la meilleure pour les antigènes intracellulaires, mais peut être modifiée pour tache de molécules de surface cellulaire ou à améliorer la coloration du cytosquelette.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological Supply Company	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson Immunoresearch	001-000-161
Hoechst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous