צומת neuromuscular (NMJ) של<em> תסיסנית melanogaster</em> היא מערכת מודל חשוב ללימוד פונקציה הסינפטי נורמלי, כמו גם הפרעות לתפקוד סינפטי נמצא מחלות נוירולוגיות מסוימות. אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של<em> תסיסנית</em> הזחל מנוע מערכת immunostaining עבור חלבונים אזור פעיל בתוך NMJ.
Neuromuscular הזחלים תסיסנית צומת (NMJ) הוא מודל מצוין לחקר מבנה ותפקוד הסינפטי ו. תסיסנית ידועה הקלות של מניפולציות גנטיות חזק ומערכת העצבים הזחל הוכיחה שימושי במיוחד ללמוד לא רק על התפקוד התקין אלא גם הפרעות המלווים כמה מחלות נוירולוגיות (לויד טיילור, 2010). רבים מולקולות הסינפטי המפתח נמצא תסיסנית מצויים גם יונקים כמו רוב CNS סינפסות מעוררות אצל יונקים, NMJ תסיסנית הוא glutamatergic ומדגים פעילות תלויי שיפוץ (Koh et al., 2000). בנוסף, נוירונים תסיסנית ניתן לזהות בנפרד כי דפוסי העצבוב שלהם סטריאוטיפי וחוזר על עצמו כך שניתן ללמוד המסופים הסינפטיים מזוהה, כגון אלה בין הנוירונים המוטוריים בגוף קיר סיבי השריר שהם innervate (Keshishian וקים, 2004). קיומם של מרכיבים סינפסה שמור באבולוציה, יחד עם הקלות של מניפולציה גנטית ופיזית הדגם תסיסנית אידיאלי לחקור את המנגנונים פונקציה הסינפטי (Budnik, 1996).
אזורי הפעילות במסופים הסינפטי הם בעלי עניין מיוחד, כי אלה הם האתרים של שחרור הנוירוטרנסמיטר. NC82 היא נוגדן חד שבטי המזהה את החלבון תסיסנית Bruchpilot (Brp), חבר משפחה CAST1/ERC כי היא מרכיב חשוב של אזור פעיל (Wagh et al. 2006). Brp הוצגה ישירות לעצב את אזור פעיל T-בר אחראי ביעילות באשכולות Ca 2 + ערוצי מתחת צפיפות T-בר (פוקה et al. 2009). מוטציות של Brp צמצמו Ca 2 + צפיפות הערוץ, שלפוחית מדוכא שחרור עורר, ואת הפלסטיות שינה לטווח קצר (קיטל et al. 2006). שינויים לאזורי פעיל נצפו דגמים תסיסנית המחלה. לדוגמה, immunofluorescence באמצעות נוגדן NC82 הראו כי צפיפות אזור פעיל צומצם במודלים של טרשת לרוחב amyotrophic ופיט-הופקינס תסמונת (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. לפיכך, ההערכה של אזורי פעילות, או חלבונים סינפטיים אחרים, מודלים תסיסנית זחלים של המחלה עשויה לספק רמז ראשוני ערך לנוכחות של פגם הסינפטי.
הכנת כל הר גזור הזחלים תסיסנית לניתוח immunofluorescence של NMJ דורש מיומנות מסוימת, אך ניתן להשיג על ידי רוב המדענים עם קצת תרגול. מוגש היא שיטה המספק עבור הזחלים מרובים כדי להיות גזור ו immunostained בצלחת לנתיחה אותו, הגבלת הבדלים סביבתיים בין גנוטיפ כל ומתן חיות מספיק אמון שחזור וניתוח סטטיסטי.
עבור נוירונים, אזור מסוף סינפטי היא בעלת חשיבות קריטית, הוא הגשר תקשורת נאותה בין הפוסט לבין מראש הסינפטי התאים. דרך רבת עוצמה כדי לחקור את בריאותם של הנוירון במודלים של המחלה היא לנתח חלבונים של המסוף הסינפטי ידי immunofluorescence. השיטה המוצגת כאן immunofluorescence מאפשרת לחוקר לב…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לד"ר Nael עלמי וד"ר נאם צ'ול קים על הערותיו המועילות שלהם על כתב היד הזה.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
Dissection Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments | 501778 | |
Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |