β-グルクロニダーゼ（GUS）に基づく細胞死アッセイ
Summary
一般的にこのようなDNAラダーやTUNELアッセイのような哺乳類のシステムで使用されるプログラム細胞死のアッセイは、しばしば植物に再現することは困難です。 GUSレポーターシステムと組み合わせることで、我々は特定の遺伝子の潜在的な死の特性を解析するために迅速、植物ベースのトランジェントアッセイを提案する。
Abstract
我々は、同時に細胞死の推定正または負の調節で、レポーター遺伝子、β-グルクロニダーゼ（GUS）を発現する新規の一時的な植物発現システムを開発した。このシステムでは、N. benthamianaの葉を分析する遺伝子を含む35S駆動発現カセットと同じ場所に浸潤、およびGUSベクターpCAMBIA 2301車両としてアグロバクテリウム株LBA4404を使用しています。生きている細胞が発生するGUSの発現に必要とされているため、このマーカー遺伝子は、細胞死の正の調節因子と共発現されると、GUS活性の損失が予想されます。同様に、GUS活性は、抗アポトーシス遺伝子をベクターコントロールと比較して使用する場合に観察される増加した。以下に示すように、我々が正常にプロと抗死のプレーヤーの両方を分析するために私たちのラボでこの制度を利用しています。これらは、植物の抗アポトーシスBcl – 2の関連athanoGene（BAG）家族だけでなく、そのようなBAXのような細胞死の既知の哺乳類の誘導を、含まれています。さらに、我々はこれらのタンパク質の可能な翻訳後修飾/アクティベーションについての手がかりを提供することができるタンパク質内の特定の切り捨て、の死の機能を解析するためにこの制度を利用しています。ここで、我々は、特定の遺伝子の死の機能を検討する上で最初のステップとして、迅速かつ高感度の植物ベースの手法を提案する。
Protocol
タバコbenthamiana植物は25℃での温度制御成長チャンバーで栽培されています。 3月6日週令の植物の完全に展開された健康な葉が使用されます。 ヒント：より良い結果が新たに出現した葉を使用して得られる 1。アグロバクテリウム一時的な浸透のプロトコル： 日1 細胞死のために、アッセイする遺伝子（群）とを含む?…
Discussion
<p class="jove_content">これは、哺乳類のシステムでは一般的な植物で細胞死の検出技術を使用することは困難です。 GUSレポーターシステムと組み合わせることで、我々は細胞死のプレイヤーの検出と解析のための植物ベースの、敏感な手法を提案する。このメソッドは、生きている細胞が発生するGUSの発現に必要であるという単純な事実を利用しています。意味のある結果と再現性を確保するためには、GUSのカ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
References
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Tags
A β-glucuronidase (GUS)Transient Plant Expression SystemReporter GenePositive Regulators Of Cell DeathN. Benthamiana LeavesCo-infiltration35S Driven Expression CassetteGene AnalysisGUS Vector PCAMBIA 2301Agrobacterium Strain LBA4404Live CellsMarker GeneAnti-apoptotic GenesPro- And Anti-death PlayersBcl-2 Associated AthanoGene (BAG) FamilyMammalian Inducers Of Cell DeathBAXPost-translational Modification/activation Of ProteinsRapid And Sensitive Plant Based Method
Citer Cet Article
Kabbage, M., Ek-Ramos, M., Dickman, M. A β-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay. J. Vis. Exp. (51), e2680, doi:10.3791/2680 (2011).