Un β-glucuronidase (GUS) dosage basé mort cellulaire

Summary

Programmé dosages mort cellulaire couramment utilisés dans les systèmes mammifères tels que l'ADN ou l'échelonnement des essais TUNEL, sont souvent difficiles à reproduire dans les plantes. En combinaison avec un système rapporteur GUS, nous proposons un rapide, usine de dosage basé transitoires pour analyser les propriétés de mort potentielle de gènes spécifiques.

Abstract

Nous avons développé un nouveau système d'expression transitoire plante qui exprime simultanément le gène rapporteur, β-glucuronidase (GUS), avec les régulateurs putatifs positifs ou négatifs de la mort cellulaire. Dans ce système, N. feuilles benthamiana sont co-infiltrée avec une cassette d'expression conduit 35S contenant le gène à analyser, et le vecteur de GUS pCAMBIA 2301 en utilisant la souche d'Agrobacterium LBA4404 comme un véhicule. Parce que les cellules vivantes sont nécessaires pour l'expression de GUS de se produire, la perte de l'activité GUS est attendue lors de ce gène marqueur est co-exprimé avec les régulateurs positifs de la mort cellulaire. De même, augmentation de l'activité GUS est observée lorsque gènes anti-apoptotiques sont utilisés par rapport à la lutte antivectorielle. Comme indiqué ci-dessous, nous avons utilisé avec succès ce système dans notre laboratoire pour analyser les deux joueurs pro et anti-mort. Il s'agit notamment de l'usine anti-apoptotique Bcl-2 Associated athanoGene (SAC) de la famille, ainsi que, connue des inducteurs de mort cellulaire chez les mammifères, tels que BAX. De plus, nous avons utilisé ce système pour analyser la fonction mort de troncatures spécifiques au sein des protéines, ce qui pourrait fournir des indices sur l'éventuelle modification post-traductionnelle / activation de ces protéines. Ici, nous présentons une méthode rapide et sensible des plantes basée, comme une première étape dans l'étude des fonctions mort de gènes spécifiques.

Protocol

Nicotiana benthamiana sont cultivés dans une chambre de croissance à température contrôlée à 25 ° C. Entièrement développé feuilles saines de 3-6 semaines vieilles plantes sont utilisées.

Astuce: De meilleurs résultats sont obtenus en utilisant des feuilles naissantes

1. Protocole de l'infiltration d'Agrobacterium transitoires:

Jour 1

1. Plaques d'agar LB Streak / rifampicine (25 pg / ml) / kanamycine (100 ug / ml) avec des stocks de glycérol d'Agrobacterium tumefaciens (souche LBA 4404) contenant les vecteurs appropriés avec les gène (s) à doser pour la mort de la ce....

Discussion

Il est souvent difficile d'utiliser des techniques de détection dans la mort cellulaire des plantes qui sont courants dans les systèmes mammifères. En combinaison avec un système rapporteur GUS, nous présentons une base de plantes, méthode sensible pour la détection et l'analyse des joueurs de mort cellulaire. Cette méthode tire parti du simple fait que les cellules vivantes sont nécessaires pour l'expression de GUS de se produire. Afin de garantir des résultats significatifs et de répétabilité, il est es.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Rifampicine	VWR	IC19549001	Stock de 25mg/ml dans le DMSO
4'-hydroxy-3 ', 5'-diméthoxyacétophénone (acétosyringone)	VWR	TCD2666	0,981 g / mL dans le DMSO (1M stock)
2 - (4-morpholino) monohydrate d'acide éthanesulfonique (MES)	VWR	EM-6110	1,92 g / L dans l'eau pour faire 1 litre de médias infiltrations
Bacto-tryptone	Fisher	BP1421-2	10g / L dans l'eau pour faire 1 litre de milieu LB
Bacto-extrait de levure	VWR	EM1.03753.0500	5g / L dans l'eau pour faire 1 litre de milieu LB
Le chlorure de sodium	VWR	EM-7710	10g / L dans l'eau pour faire 1 litre de milieu LB
Le phosphate de sodium monobasique monohydraté	VWR	MK-7868-12	2.5g / L dans l'eau pour faire 50 mM de tampon NaPi
Le phosphate de sodium dibasique heptahydraté	VWR	EMD-SX0715-1	5g / L dans l'eau pour faire 50 mM de tampon NaPi
Sulfate de magnésium heptahydraté	VWR	EM-MX0070-1	2,5 g / L dans l'eau pour faire 1 litre de médias infiltrations
N-Lauroylsarcosine	VWR	TCL0151-500G	0,1% v / v dans du tampon GUS
5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide sel cyclohexylammonium (X-gluc)	Or la biotechnologie	G1281C	1mg/100uL dans le méthanol à 100%
4-méthyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG)	Sigma	M5664	2 mM dans 100 uL de tampon d'extraction GUS
Le potassium trihydraté ferrocyanure	VWR	EM-PX1460-1	Stock de 100 mm pour une solution de substrat X-gluc
β-méthylumbelliférone (MU)	Sigma-Aldrich	M1381	Pour MU tampon, utilisez courbe standard d'extraction GUS
Le carbonate de sodium	VWR	EM-SX0395-11	0,2 M dans de l'eau pour faire GUS butoir