Изображений гликанов в данио рерио Эмбрионы от метаболического Маркировка и Bioorthogonal химии нажмите
Summary
Клик-химии основан метод, который позволяет оперативно, неинвазивным и надежный маркировки алкин с метками гликанов в данио эмбрионов описано. Фукозилированных гликанов в обертывающей слой данио эмбрионов в поздней стадии гаструляции были обследованы в этом исследовании.
Abstract
Изображений гликанов в естественных условиях была недавно включена с использованием bioorthogonal стратегии репортер химической обработкой клеток или организмов с азид или алкин с метками моносахаридов 1, 2. Изменение моносахаридов, обрабатывается механизм биосинтеза гликана, включаются в гликоконъюгатов поверхности клетки. Bioorthogonal теги или азид алкин затем позволить ковалентные сопряжения с флуоресцентных зондов для визуализации, или с близостью зонды для обогащения и glycoproteomic анализа. Этот протокол описывает процедуры, как правило, используется для неинвазивной визуализации фукозилированных гликанов в данио эмбрионов, в том числе: 1) микроинъекции одноклеточного эмбриона сцене с ВВП-5-alkynylfucose (ВВП-FucAl), 2) маркировка фукозилированных гликанов в обертывающей слой данио эмбрионов с азид-сопряженных флуорофоров с помощью биосовместимых Cu (I)-катализируемой азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC), и 3) изображений с помощью конфокальной микроскопии 3. Метод, описанный здесь, может быть легко распространено на себе другие классы гликанов, например гликанов содержащие сиаловой кислоты 4 и N-ацетилгалактозамина 5, 6, в развивающихся данио и других живых организмов.
Protocol
Discussion
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здоровья (GM093282 для PW; 3U54AI057158-06S1 с RDS) и ввод в эксплуатацию средств из колледжа Альберта Эйнштейна медицины.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 |
| Glass bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C |
References
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D. Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans. J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).
- Chang, P. V. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).
- Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
- Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. , (2009).
- Wang, W. Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. , (2009).
- Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
