Imaging glycans i Zebrafish embryon genom Metabola märkning och Bioorthogonal Klicka Kemi

Summary

Ett klick-kemi baserad metod som möjliggör en snabb, icke-invasiv, och robust märkning av alkyne-märkta glykaner i zebrafisk embryon beskrivs. Fucosylated glykaner i de omgivande lager av zebrafisk embryon i slutet gastrulation skede fanns avbildad i denna studie.

Abstract

Imaging glycans in vivo har nyligen blivit möjligt tack vare en bioorthogonal strategi kemiska reporter genom att behandla celler eller organismer med azide-eller alkyne-taggade monosackarider ^{1, 2.} Den modifierade monosackarider, bearbetas av glycan biosyntetiska maskiner, ingår i Glycoconjugates cellytan. Den bioorthogonal azide eller alkyne taggar kan sedan kovalenta konjugering med fluorescerande prober för visualisering, eller med affinitet givare för anrikning och glycoproteomic analys. Detta protokoll beskriver de förfaranden som vanligtvis används för icke-invasiv avbildning av fucosylated glykaner i zebrafisk embryon, inklusive: 1) mikroinjektion av en-cells embryon skede med BNP-5-alkynylfucose (BNP-FucAl), 2) märkning fucosylated glykaner i kuvertering lagret av zebrafisk embryon med azide-konjugerad fluoroforer via biokompatibla Cu (I)-katalyserad azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), och 3) avbildning av konfokalmikroskopi ^3. Den metod som beskrivs här kan lätt utvidgas till att visualisera andra grupper av glykaner, t.ex. glycans innehåller sialinsyra ⁴ och N-acetylgalaktosamin ^{5, 6,} utveckla zebrafisk och andra levande organismer.

Protocol

1. Insamling av ägg och Dechorionation Samla in och överföra zebrafisk ägg till 35 mm petriskål, ta bort så mycket vatten som möjligt och sedan lägga till 1 mg / ml Pronease E i E3 embryo medelstora (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) att smälta chorion. Efter 3-5 minuter, slå ihop skålen i en bägare fylld med fisk vatten (60 mg "instant Ocean" per liter destillerat H 2 O), och försiktigt öve…

Discussion

<p class="jove_content"> Imaging biomolekyler<em> In vivo</em> Ger värdefull kunskap om sin biologiska aktiviteter på sitt eget miljöer. I den här filmen visar vi hur märkning av fucosylated glykaner i de omgivande lager av zebrafisk embryon realiseras genom microinjecting en-cells stadiet embryon med BNP-FucAl och ett andra steg fluoroforen konjugering via BTTES-medierad biokompatibelt CuAAC³. Robust märkning kan uppnås inom 2-3 minuter, och den märkta glycans är mätbara så tidigt som 2,5 HPF. Viktigare, k…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number
Copper(II) sulfate pentahydrate	Sigma-Aldrich	203165
Alexa Fluor 488 azide	Invitrogen	A10266
dextran, Alexa Fluor 594	Invitrogen	D-22913
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
Bathocuproinedisulfonic acid	Acros Organics	164060010
Glass bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C