Imaging glycanen in zebravis embryo's door metabole Labeling en Bioorthogonal Klik Chemie

Summary

Een klik-chemie gebaseerde methode die het mogelijk maakt voor de snelle, niet-invasieve, en robuuste etikettering van alkyn-tagged glycanen in zebravis embryo's wordt beschreven. Gefucosyleerde glycanen in de omhullende laag van de zebravis embryo's in de late gastrulatie stadium waren afgebeeld in deze studie.

Abstract

Imaging glycanen in vivo is onlangs ingeschakeld met een bioorthogonal chemische verslaggever strategie door het behandelen van cellen of organismen met een azide-of alkyn-tagged monosachariden ^{1, 2.} De gewijzigde monosacchariden, verwerkt door de glycan biosynthetische machines, worden opgenomen in het celoppervlak glycoconjugaten. De bioorthogonal azide of alkyn labels laat vervolgens covalente conjugatie met fluorescerende probes voor visualisatie, of met affiniteit probes voor verrijking en glycoproteomic analyse. Dit protocol beschrijft de procedures doorgaans gebruikt voor niet-invasieve beeldvorming van de gefucosyleerde glycanen in zebravis embryo's, waaronder: 1) micro-injectie van een-cellig stadium embryo's met een BBP-5-alkynylfucose (BBP-FucAl), 2) de etikettering gefucosyleerde glycanen in de omhullende laag van zebravis embryo's met azide-geconjugeerde fluoroforen via biocompatibel Cu (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC), en 3) beeldvorming door confocale microscopie ^3. De hier beschreven methode kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere klassen van glycanen, bv. glycanen bevat sialinezuur ⁴ en N-acetylgalactosamine ^{5, 6,} bij de ontwikkeling van de zebravis en in andere levende organismen te visualiseren.

Protocol

1. Ei Verzamelen en Dechorionation Verzamelen en zebravis eieren tot 35mm petrischaal overdracht, verwijder zoveel mogelijk water en voeg dan 1 mg / ml Pronease E in E3 embryo medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) aan de chorion verteren. Na 3-5 minuten, het samenvoegen van de schotel in een bekerglas gevuld met vis water (60 mg "instant Ocean" per liter gedestilleerd H 2 O), en voorzichtig de eieren …

Discussion

<p class="jove_content"> Imaging biomoleculen<em> In vivo</em> Biedt kritische inzichten van hun biologische activiteiten in hun eigen omgeving. In deze video laten we zien hoe de etikettering van gefucosyleerde glycanen in de omhullende laag van de zebravis embryo's is gerealiseerd door microinjecting een-cellig stadium embryo's met een BBP-FucAl en een tweede voor-stap fluorofoor conjugatie via BTTES-gemedieerde biocompatibel CuAAC³. Robuuste de etikettering kunnen worden bereikt binnen 2-3 minuten, en de ge…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number
Copper(II) sulfate pentahydrate	Sigma-Aldrich	203165
Alexa Fluor 488 azide	Invitrogen	A10266
dextran, Alexa Fluor 594	Invitrogen	D-22913
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
Bathocuproinedisulfonic acid	Acros Organics	164060010
Glass bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C