Glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et Chimie Cliquez Bioorthogonal
Summary
Une méthode basée cliquez-chimie qui permet la rapidité, l'étiquetage non invasive, robuste et d'alcyne-taggés glycanes dans des embryons de poisson zèbre est décrite. Glycanes fucosylé dans la couche enveloppant des embryons de poisson zèbre au stade de la gastrulation tardive ont été imagées dans cette étude.
Abstract
Glycanes d'imagerie in vivo a été récemment activé en utilisant une stratégie chimique bioorthogonal journaliste en traitant des cellules ou organismes avec monosaccharides azide ou alcyne-marqués 1, 2. Les monosaccharides modifiés, transformés par la machinerie de biosynthèse glycane, sont incorporés dans les glycoconjugués de surface cellulaire. Les balises bioorthogonal azoture ou alcyne puis laisser conjugaison covalente avec des sondes fluorescentes pour la visualisation, ou avec des sondes d'affinité pour l'enrichissement et l'analyse glycoproteomic. Ce protocole décrit les procédures généralement utilisées pour l'imagerie non invasive des glycanes fucosylé dans embryons de poissons zèbres, notamment: 1) la microinjection d'une cellule embryons au stade avec un PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) l'étiquetage glycanes fucosylé dans la couche enveloppante de embryons de poissons zèbres avec l'azoture de conjugué fluorophores via Cu biocompatible (I)-catalysée azide-alcyne cycloaddition (CuAAC), et 3) l'imagerie par microscopie confocale 3. La méthode décrite ici peut être facilement étendu pour visualiser d'autres catégories de glycanes, glycanes contenant par exemple l'acide sialique 4 et N-acétyl 5, 6, chez le poisson zèbre en développement et dans d'autres organismes vivants.
Protocol
Discussion
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été partiellement financé par le National Institutes of Health (GM093282 à PW; 3U54AI057158-06S1 à RDS) et les fonds de démarrage de l'Albert Einstein College of Medicine.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 |
| Glass bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C |
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