Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Hao Jiang; Lei Feng; David Soriano del Amo; Ronald D. Seidel III; Florence Marlow; Peng Wu

doi:10.3791/2686

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Biologie

Imaging Glykane in Zebrafisch-Embryonen durch metabolische Markierung und Bioorthogonale Click-Chemie

Published: June 06, 2011

doi:

10.3791/2686

Hao Jiang, Lei Feng, David Soriano del Amo, Ronald D. Seidel III, Florence Marlow, Peng Wu

¹Department of Biochemistry,Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University, ²Macromolecular Therapeutics Development Facility,Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University, ³Developmental and Molecular Biology,Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University

Summary

Ein Klick-Chemie basierende Methode, die für die schnelle, nichtinvasive und robuste Kennzeichnung von Alkin-markierten Glykane in Zebrafisch-Embryonen erlaubt wird beschrieben. Fucosylierte Glykane in der umhüllenden Schicht von Zebrafisch-Embryonen in den späten Gastrulation Bühne wurden in dieser Studie abgebildet.

Abstract

Imaging Glykane in vivo wurde vor kurzem durch die Verwendung einer bioorthogonale chemischen Reporter, indem man Zellen oder Organismen mit Azid-oder Alkin-markierten Monosacchariden ^{1, 2.} Die modifizierte Monosaccharide, durch die Glykan Biosynthese-Maschinerie verarbeitet, sind in der Zelloberfläche Glycokonjugate eingearbeitet. Die bioorthogonale Azid-oder Alkin-Tags dann eine kovalente Konjugation mit fluoreszierenden Sonden für die Visualisierung oder mit Affinitätssonden zur Anreicherung und glycoproteomic Analyse. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren in der Regel für nicht-invasive Bildgebung von fucosylierte Glykane in Zebrafisch-Embryonen verwendet werden, einschließlich: 1) Mikroinjektion von one-Zell-Stadium Embryos mit einem BIP-5-alkynylfucose (BIP-FucAl), 2) Kennzeichnung fucosylierte Glykane in der umhüllenden Schicht aus Zebrafisch-Embryos mit Azid-konjugierten Fluorophore über biokompatible Cu (I)-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) und 3) Bildgebung durch konfokale Mikroskopie ^3. Die hier beschriebene Methode kann leicht erweitert werden, um andere Klassen von Glykane, zB Glykane mit Sialinsäure ⁴ und ^{N-Acetyl-5, 6,} bei der Entwicklung von Zebrafisch und in anderen Lebewesen zu visualisieren.

Protocol

1. Egg Collection und Dechorionation Sammeln und Transfer Zebrafisch-Eier zu 35mm Petrischale, so viel Wasser wie möglich zu entfernen und fügen Sie dann 1 mg / ml Pronease E in E3 Embryo Medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4), um das Chorion zu verdauen. Nach 3-5 Minuten verschmelzen die Schüssel in ein Becherglas mit Fisch Wasser (60 mg "Instant Ocean" pro Liter destilliertem H 2 O) gefüllt und s…

Discussion

Imaging Biomolekülen In vivo Liefert wichtige Erkenntnisse ihrer biologischen Aktivitäten in ihrer natürlichen Umgebung. In diesem Video zeigen wir, wie die Kennzeichnung von fucosylierte Glykane in der umhüllenden Schicht von Zebrafisch-Embryonen durch Mikroinjektion one-Zell-Stadium Embryos mit einem BIP-FucAl und eine zweite für-Schritt-Fluorophor Konjugation über BTTES-vermittelte biokompatiblen CuAAC realisiert 3. Robust Kennzeichnung kann innerhalb von 2-3 Minuten erreicht …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Und Anschubfinanzierung von Albert Einstein College of Medicine; Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health (3U54AI057158-06S1 zu RDS GM093282 zu PW) unterstützt.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number
Copper(II) sulfate pentahydrate	Sigma-Aldrich	203165
Alexa Fluor 488 azide	Invitrogen	A10266
dextran, Alexa Fluor 594	Invitrogen	D-22913
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
Bathocuproinedisulfonic acid	Acros Organics	164060010
Glass bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C

References

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Citer Cet Article

Jiang, H., Feng, L., Soriano del Amo, D., Seidel III, R. D., Marlow, F., Wu, P. Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (52), e2686, doi:10.3791/2686 (2011).