Glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et Chimie Cliquez Bioorthogonal

Résumé

Une méthode basée cliquez-chimie qui permet la rapidité, l'étiquetage non invasive, robuste et d'alcyne-taggés glycanes dans des embryons de poisson zèbre est décrite. Glycanes fucosylé dans la couche enveloppant des embryons de poisson zèbre au stade de la gastrulation tardive ont été imagées dans cette étude.

Résumé

Glycanes d'imagerie in vivo a été récemment activé en utilisant une stratégie chimique bioorthogonal journaliste en traitant des cellules ou organismes avec monosaccharides azide ou alcyne-marqués ^{1, 2.} Les monosaccharides modifiés, transformés par la machinerie de biosynthèse glycane, sont incorporés dans les glycoconjugués de surface cellulaire. Les balises bioorthogonal azoture ou alcyne puis laisser conjugaison covalente avec des sondes fluorescentes pour la visualisation, ou avec des sondes d'affinité pour l'enrichissement et l'analyse glycoproteomic. Ce protocole décrit les procédures généralement utilisées pour l'imagerie non invasive des glycanes fucosylé dans embryons de poissons zèbres, notamment: 1) la microinjection d'une cellule embryons au stade avec un PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) l'étiquetage glycanes fucosylé dans la couche enveloppante de embryons de poissons zèbres avec l'azoture de conjugué fluorophores via Cu biocompatible (I)-catalysée azide-alcyne cycloaddition (CuAAC), et 3) l'imagerie par microscopie confocale ^3. La méthode décrite ici peut être facilement étendu pour visualiser d'autres catégories de glycanes, glycanes contenant par exemple l'acide sialique ⁴ et N-acétyl ^{5, 6,} chez le poisson zèbre en développement et dans d'autres organismes vivants.

Protocole

1. Collecte d'oeufs et Dechorionation

1. Recueillir et transférer les œufs de poisson zèbre à 35mm boîte de Petri, retirer autant d'eau que possible et ensuite ajouter 1 E Pronease mg / ml dans le milieu d'embryon E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM CaCl ₂ · 2H ₂ O, 0,33 mM MgSO _4, pH = 7,4) pour digérer le chorion.
2. Après 3-5 minutes, fusionner le plat dans un bécher rempli d'eau les poissons (60 mg "Instant Ocean" par litre distillée H ₂ O), et doucement transférer les oeufs dans le bécher et permettre les œufs pour "tomber" dans l'eau.
3. Rincer les oeufs avec l'eau du poisson trois fois. La....

Discussion

Biomolécules Imaging In vivo Fournit des indications essentielles de leurs activités biologiques dans leurs milieux d'origine. Dans cette vidéo, nous montrons comment l'étiquetage des glycanes fucosylé dans la couche enveloppant des embryons de poisson zèbre est réalisée par micro-injection embryons au stade une cellule avec le PIB-FucAl et une conjugaison fluorophore deuxième étape intermédiaire BTTES médiée CuAAC biocompatible ³. Robuste étiquetage peut être réalisé dans les .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Le numéro de catalogue
Pentahydrate de sulfate de cuivre (II)	Sigma-Aldrich	203165
Alexa Fluor 488 azoture	Invitrogen	A10266
dextrane, Alexa Fluor 594	Invitrogen	D-22913
(+)-L-ascorbate de sodium	Sigma-Aldrich	A7631
Bathocuproinedisulfonic l'acide	Acros Organics	164060010
Fond de verre plat de micropuits	MatTek	P35G-1.5-14-C