Glicanos imágenes en embriones de pez cebra mediante marcado metabólico y Química Haga clic Bioorthogonal
Summary
Un método de hacer clic química base que permite el etiquetado rápido, no invasivo, y robusto de alquino con etiquetas glicanos en embriones de pez cebra se describe. Glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra en la etapa de gastrulación finales fueron estudiados en este estudio.
Abstract
Glicanos de imágenes en vivo ha sido recientemente habilitada mediante una estrategia de química reportero bioorthogonal por el tratamiento de las células u organismos con los monosacáridos azida o alquino etiquetados-1, 2. Los monosacáridos modificados, procesados por la maquinaria biosintética de glicanos, se incorporan a glicoconjugados de la superficie celular. Las etiquetas bioorthogonal azida o alquino luego permitir que la conjugación covalente con sondas fluorescentes para la visualización, o con sondas de afinidad para el enriquecimiento y el análisis glycoproteomic. Este protocolo describe los procedimientos que normalmente se utiliza para obtener imágenes no invasivo de los glicanos fucosilados en embriones de pez cebra, incluyendo: 1) la microinyección de una célula de embriones etapa con el PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) El etiquetado glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra con azida fluoróforos conjugados a través de Cu biocompatible (I) catalizada por azida-alquino cicloadición (CuAAC), y la imagen 3) por microscopía confocal 3. El método descrito aquí puede extenderse fácilmente para visualizar las otras clases de glicanos, por ejemplo, los glicanos que contienen ácido siálico 4 y N-acetilgalactosamina 5, 6, en el pez cebra en desarrollo y en otros organismos vivos.
Protocol
Discussion
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue parcialmente financiado por los Institutos Nacionales de Salud (GM093282 a PW; 3U54AI057158-06S1 de RDS) y los fondos de puesta en marcha de Albert Einstein College of Medicine.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 |
| Glass bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C |
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