Summary
一个协议，由细菌病原体入侵宿主细胞的研究一般，注重
Abstract
在这里，我们将描述我们如何研究细菌病原体的金黄色葡萄球菌的人类内皮细胞的入侵。一般的协议，可以适用于几乎任何可培养细菌的细胞侵袭的研究。可以研究在哪些具体方面的入侵阶段，如对肌动蛋白重排或小窝的作用，将突出显示。宿主细胞是生长在烧瓶中，并准备使用时，种子Thermanox盖玻片的24孔板。使用盖玻片允许随后从井的细胞去除，以减少血清蛋白沉积到井（ 金黄色葡萄球菌会附上）双方的干扰。细菌生长所需的密度和清洗，以消除任何分泌蛋白（如毒素）。与融合的内皮细胞层的盖玻片被转移到新的24孔板中，含有新鲜培养液中的细菌除了前。细菌和细胞培养在5％的CO 2一起，所需的时间，金额在37 ° C 。为S.这个金黄色葡萄球菌通常是15-90分钟之间。 Thermanox盖玻片从每口井，并浸在PBS洗去独立的细菌。如果相关的细菌总数（壁和内在）予以量化，盖玻片，然后放置在一个新鲜的以及含有0.5％的Triton X - 100的PBS中。轻柔吹打，导致完整的细胞裂解和细菌连续稀释和电镀列举到琼脂。如果细菌侵入细胞的数量是必要的，盖玻片添加到井含500μL组织培养基辅以庆大霉素和孵化，持续1小时，这将杀死所有外部的细菌。然后可以洗盖玻片，细胞裂解和细菌列举到琼脂电镀如上所述。如果实验需要直接可视化，盖玻片，可以固定和染色光，荧光或共聚焦显微镜或电子显微镜的准备。
Protocol
以下协议将介绍由S.研究内皮细胞的侵袭金黄色葡萄球菌 ，但理论上可以用来研究任何可培养的细菌细胞的入侵。 到 S阶段的具体金黄色葡萄球菌和血管内皮细胞的表示。
1。细菌的制备
- 文化S。 4-16 H（上生长阶段所需而定）在10毫升的脑心浸液（BHI）肉汤在37 ° C在空气中晃动在200转金黄色葡萄球菌菌株。这些生长条件具体为S.金黄色葡萄球菌和可能需要对其他细菌的适应。
- 洗净细菌三个贝科的修改鹰的培养基倍（DMEM培养液; Invitrogen公司）离心备用轮在房间温度（5000 x 克 ，10分钟），去除一个的DMEM相当于体积的文化上清和的细菌沉淀重新悬浮。然后可以根据需要调整的细菌产生的悬浮测量光密度。为S.金黄色葡萄球菌，我们准备在外径600 = 1〜10 9 CFU毫升-1，对应暂停。
2。内皮细胞培养
- 文化内皮细胞株EA.hy926 1的DMEM补充胎牛血清（FBS，10％）在37和L -谷氨酰胺（2毫米）℃，5％的CO 2。另外，汇集小学的人脐静脉（内皮细胞）的内皮细胞可以购买从龙沙（瑞士巴塞尔，）和内皮基底介质与2％FBS，牛脑提取物（包括肝素），人血管内皮生长因子和氢化可的松，在37培养℃，5％CO 2，根据制造商的说明（龙沙） 。这些增长的条件是针对这些细胞和其他类型的宿主细胞，可能需要适应。
- 血管内皮细胞生长在T75烧瓶完成汇合，用肉眼验证。
- 准备插入的盖玻片的24孔板。精细镊子（火焰消毒）需要移动盖玻片，其中有一个不透明的，表面有光泽。在24孔板与不透明表面朝上，让细胞附着井发生盖玻片。
- 从3毫升胰蛋白酶- EDTA（0.25％）与T75烧瓶中解放出来的细胞，并添加到10毫升的有关培养基。
- 添加500μL悬浮细胞Thermanox盖玻片的24孔板。一个T75细胞融合烧瓶两个24孔板提供足够的细胞，造成约5 × 10 5个细胞（500μL介质） 。
- 孵育48小时板块如上所述，并验证100％细胞汇合倒光镜。
- 浸在PBS冲洗盖玻片，并添加新的24孔板中，含有490μLDMEM培养液，每孔含10％胎牛血清。
- 为了研究细胞浸润在特定的代谢过程中的作用，抑制剂可以被添加到培养的细胞1小时之前，除了细菌和浓度保持在检测。例如，要确定的肌动蛋白重排的 S中的作用黄色葡萄球菌的内皮细胞的侵袭，50微米的细胞松弛素D可以添加或作用的小窝，5毫米甲基-β-环糊精可以增加。
3。侵袭实验
- 加入洗净的细菌10μL（约2 × 10 7 CFU 毫升 -1金黄色葡萄球菌）以及包含在490μLDMEM培养液与内皮细胞的融合层含10％胎牛血清的一个洗涤盖玻片。
- 孵育15-90分钟，在37℃，5％CO 2的彗星。
- 要测量的细胞（贴壁和内在）的细菌总数，浸洗盖玻片在PBS的3倍，并添加到PBS中含有500μL0.5％Triton X - 100的的新鲜井。为了确保细胞充分裂解，并释放所有的内在细菌，吸几次，直接在盖玻片表面的尖端指向移液器。
- 列举细菌悬浮液（或稀释，这在必要时）TSA的板表面镀上。由于TX - 100裂解许多革兰阴性菌，皂甙，可以用来代替 2 。
- 要衡量化的细菌数量，请从每口井含有未绑定的细菌培养上清和替换500μLDMEM/10％FBS的补充200微克毫升-1庆大霉素。我们经常使用庆大霉素而比溶葡球菌酶，因为它是便宜的，让我们实验使用不同类型的细菌（如葡萄球菌和Lactococci）之间进行切换，而无需改变实验的协议。
- 板在37 ° C在5％CO 2为60分钟，杀死所有外细菌。
- 洗盖玻片在PBS的3倍，裂解枚举镀上TSA的描述上面的粘附实验。
- 在某些情况下它可能是最好目视计数使用光学显微镜的细菌数量。在这种情况下，具体到 S 金黄色葡萄球菌细胞的侵袭，使用溶葡球菌酶（-1毫升10微克），而不是庆大霉素，物理破坏外细菌。
- 在37 ° C的CO 2的溶葡球菌酶的解决方案，然后用清水冲洗并修复Cytopath（Cellpath）为20分钟盖玻片。
- 洪水与结晶紫（0.5％，W / V）为5min盖玻片。
- 浸在水，空气干燥冲洗，并安装到玻片上。利用光镜，可以量化融合的内皮细胞每平方毫米2的细菌数量。
4。代表性的成果：
纤维连接蛋白结合蛋白的表达 S的表面上（FnBPA和FnBPB ） 金黄色葡萄球菌赋予侵入血管内皮细胞的能力。最近的工作重新FnBPA 3纤维连接蛋白结合结构域。野生型（WT）S金黄色葡萄球菌 8325.4侵入内皮细胞具有效率高，而应变，缺乏FnBPA和B（ΔFNB）显示的内部化水平显着降低（图1A） 。与质粒编码FNB的突变体的互补A减去纤维连接蛋白结合结构域（pFnR0）没有促进入侵（图1A ）。相比之下，与质粒编码整个FNB（pFnBA4）入侵恢复到野生型水平（图1A）一个基因突变的互补性。
FnBPA在内皮细胞的侵袭中的作用也可以证明使用的异源表达主机乳酸乳球菌。表达质粒编码的FnBPA 在 L 球菌 （pRM9 9）没有显着增强附着力内皮细胞相比，细菌表达没有FnBPA（CTL）（开放的酒吧，图1B） 。相比之下，FnBPA表达L。比非表达株（封闭式酒吧，图1B）水平显着高于球菌入侵血管内皮细胞。
实验进行了四次重复和均值±标准差是。 *代表WT或CTL值显着性差异（P <0.05）的数据。
图1。EA的入侵。 Hy926内皮细胞由 S 金黄色葡萄球菌 （A）或L。球菌 （二）。
Discussion
我们所描述的实验是基于对庆大霉素保护法，已广泛用于研究细菌的宿主细胞的入侵。在早期的研究中利用宿主细胞的入侵细菌 4-8庆大霉素等抗生素杀死细胞内的细菌无法观测。 24，48甚至96孔板的使用，可以生成大量定量，在很短的时间内，在相对较低的成本的重复性数据。该检测也有吸引力，因为它不需要专门设备，它可以根据工作与各种细菌和细胞，可用于研究9入侵细菌和宿主细胞的过程中的作用。事实上，自从最早的实验，庆大霉素保护法已被广泛采用的措施，通过一系列不同的细菌或细菌 10,11甚至组合的宿主细胞浸润。虽然核心原则的方法相同，许多微妙的变化已有报道。在这篇文章中，我们已经描述了我们的版本，并表示，修改可能对其他细菌或宿主细胞所必需的。当设计一个实验来测量使用这种方法也有一些重要的点要考虑的宿主细胞的入侵：
细菌对庆大霉素的敏感性，这可能似乎是显而易见的的，但重要的是要确保正在研究细菌容易对庆大霉素的浓度，温度，并在要使用的持续时间。在不敏感的情况下，它可能会使用其他抗生素 5 。另一种方法，可以用裂解酶（溶葡球菌酶，溶菌酶，mutanolysin）12。
培育和接种时首次执行这个实验中，重要的是要建立的孵育时间和要使用的细菌接种。因此，最初的实验研究随着时间的推移都粘附和侵袭（5分钟到最多6小时）。同样重要的是，以评估如何入侵是感染的多重影响（教学语言;每个细胞中的细菌数）。一般情况下，最好使用最少数量的细菌可能，因为这将减少培养细胞的损害。如果延长的潜伏期或大菌剂使用9,13株之间的重要区别，可能会错过。
细胞损伤。重要的是洗的细菌，在使用前。然而，细胞损伤并不局限于产毒。细菌的侵袭，诱导细胞凋亡和破坏正常的细胞功能都可以引起细胞损伤。这可能会导致庆大霉素渗透进入细胞，造成内在的细菌和给人的印象，入侵并没有发生 14 。
孵化条件。培养基的温度和组成可以有一个入侵的重大影响。例如，由化脓性链球菌的侵袭HeLa细胞依赖的可溶性纤维连接蛋白的存在，这通常是在血清15。另一个要考虑的是在培养液中的细菌生长，在实验的过程中。
文化和细胞内细菌的定量 。虽然TX - 100可能不会杀死细胞内的细菌，它可能会抑制其生长。因此，重要的是要检查固体介质中存在的洗涤剂的细菌复制。凡影响，它可能会使用低浓度的洗涤剂，或使用替代，如皂甙。在结晶紫染色和显微镜检测庆大霉素保护法的一个好处是，它是劳动力密集型少，并允许内在细菌亚群的检测和分化。例如，第金黄色葡萄球菌能产生正常殖民地类型（NCT）或小殖民地变种（SCV）16，这将不个别细菌细胞的显微镜不同。结晶紫染色和显微镜检测对庆大霉素保护法的一个好处是可以和细胞内的细菌进入一个“可行的，但非可培养”的状态将被检测的17个，占的细胞聚集。
研究细菌的入侵宿主细胞的过程中的作用。许多研究都采用主机细胞的功能，如细胞松弛素D，这与肌动蛋白重排干扰抑制剂。这种研究也可以包括抗体，18个特定的基因敲除的靶细胞表面的受体和siRNA。这是非常重要的，以确保这些治疗不影响培养细胞的生存能力或附件或对细菌的毒性作用。
未来的方向：
ontent“>由于这种检测通常是在执行多孔细胞培养板，理论上是可能的，以使其适应高通量筛选操作，这可能涉及审查潜在的细胞功能抑制剂库，抗感染药或的或者设计目标细胞内细菌的抗生素。，这种做法可以用来筛选突变体库，以确定参与黏附，侵袭或内生存的基因，在某些情况下它可能是可取的，包括剪切力的模型系统（流动），例如建模时内皮，更加紧密地模拟体内环境中的电流在流动细胞和微流体细胞培养系统的设计和制造的进步提供在宿主病原体模型纳入剪切力的用人庆大霉素保护法的可能性。总之，这里所描述的协议是基于多年来使用的类似的方法。它广泛适用于多种类型的培养细胞和细菌种类，并能产生大量数据的快速和相对较少的成本。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由威康信托基金会（WT 0795880）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | |
| F–tal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| Endothelial basal medium | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| Human endothelial growth factor | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| Hydrocortisone | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | |
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 flasks | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | 332615 |
References
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).
- Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).
- Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper. Nature. 423, 177-181 (2003).
- Magoffin, R. L., Spink, W. W. The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).
- Mandell, G. L.
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).
- De Melo, M. A., Pechere, J. C. Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells. Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).
- Shaw, J. H., Falkow, S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae. Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).
- Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA. PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).
- Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).
- Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells. Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis. Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).
- Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).
- Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).
- Eiff, C. von Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).
- Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells. Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).
