Biomolecular איתור העסקת ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS)

Summary

כמותי, תפוקה גבוהה, בזמן אמת, וכן ללא תווית זיהוי biomolecular (דנ"א, חלבונים, וכו ') על SiO₂ משטחים יכולה להיות מושגת באמצעות טכניקה פשוטה interferometric אשר מסתמכת על תאורת LED, רכיבים אופטיים מינימלית, מצלמה. ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS) הוא זול, פשוט לשימוש, והוא מקובל microarray פורמטים.

Abstract

מדידה רגישה של אינטראקציות biomolecular יש להשתמש בשדות בתעשיות רבות כגון ביולוגיה בסיסית מיקרוביולוגיה, ניטור סביבתי / חקלאות / biodefense, nanobiotechnology, ועוד. עבור יישומים אבחון, מעקב (גילוי) נוכחות, היעדרות, או ביטוי נורמלי של סמנים ביולוגיים או proteomic גנומית ממוקד נמצאו בדגימות המטופל יכול לשמש כדי לקבוע גישות טיפוליות או יעילות הטיפול. בזירה מחקר, מידע על זיקות ספציפיות ו מולקולרית שימושיים מלא ואפיון מערכות תחת חקירה.

רבים מן המערכות הקיימות מועסקים לקבוע ריכוזים מולקולריים או זיקות מסתמכים על השימוש בתוויות. דוגמאות של מערכות אלה כוללות immunoassays כגון assay האנזים צמוד immunosorbent (ELISA), שרשרת התגובה פולימראז (PCR) טכניקות, ג'ל אלקטרופורזה מבחני, ו ספקטרומטריית מסה (MS). באופן כללי, תוויות אלו ניאון, רדיולוגי או colorimetric בטבע מחוברים באופן ישיר או עקיף למקד המולקולרי של עניין. למרות השימוש בתוויות מקובל ויש לו כמה יתרונות, יש חסרונות אשר מגרה את התפתחות ללא תווית שיטות חדשות למדידת האינטראקציות הללו. חסרונות אלה כוללים היבטים מעשיים כגון עלות assay מוגברת, מגיב תוחלת החיים ודאגות, השימושיות אחסון בטיחות, בזבוז זמן ומאמץ תיוג, ולהבדלים בין חומרים כימיים שונים עקב תהליכי תיוג או תוויות עצמם. על בסיס מחקרים מדעיים, שימוש בתוויות אלה יכולים גם להציג את הקשיים כגון חששות עם אפקטים על פונקציונליות חלבון / מבנה בשל נוכחותם של תוויות המצורפת וחוסר היכולת למדוד ישירות את האינטראקציות בזמן אמת.

מוגש כאן הוא השימוש biosensor ללא תווית חדשה אופטי ניתנת microarray מחקרים, הגדיר את ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS), עבור גילוי חלבונים, DNA, החומר antigenic, פתוגנים שלם (virions) ו חומר ביולוגי אחר. המערכת IRIS הוכח שיש רגישות ודיוק גבוה, reproducibility עבור אינטראקציות שונות biomolecular [1-3]. היתרונות כוללים הדמיה זמנית יכולת, בזמן אמת יכולות המדידה הסיום, ועוד תפוקה גבוהה תכונות כגון צריכת מגיב מופחת וירידה פעמים assay. בנוסף, הפלטפורמה IRIS הוא פשוט לשימוש, דורש ציוד יקר, מנצל מבוססי סיליקון מוצק assay רכיבים שלב מה שהופך אותו תואם הרבה גישות כימיה העכשווית פני השטח.

כאן, אנו מציגים את השימוש במערכת IRIS של הכנת מערכי בדיקה ומדידה של דגירה יעד מחייב ניתוח של התוצאות בפורמט נקודת קצה. מערכת מודל יהיה ללכוד היעד של נוגדנים ספציפיים אשר אלבומין בסרום אדם (HSA) על HSA-הבחינו מצעים.

Protocol

1. הכנת התשתית מעיל שכבות סיליקון SiO 2 מצעים עם עצמי adsorbing copoly (DMA-NAS-MAPS): סינתזה קופולימר, המבנה הכימי, ואת תהליך ציפוי מתפרסמים: G. Pirri, פ Damin, מ Chiari, א Bontempi, LE Depero. אפיון ציפוי adsorbed פולימריים עבור שקופיות DNA microarray זכוכית. אנאלי. Chem. 2004, 76, 1352-1358. בקיצור, להכין פתרון פולימר ידי הוספת 100 מ"ג של פולימר 5 מ"ל מים (די) deionized ולהוסיף 5 מ"ל של אמוניום סולפט 40% שומן רווי ((NH 4) 2SO 4) פתרון להגיע הריכוז הסופי של 0.92 מ ' שבבי לצלול בתמיסה למשך 30 דקות על שייקר ולאחר מכן לשטוף היטב במים DI. יבש ביסודיות עם ארגון / N 2 גז. שבבי אופים בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. חנות פולימר מצופה מצעים / שבבי בסביבה יבשה (ייבוש ואקום) לתקופה של עד 3 חודשים עד איתור הליך בדיקה. 2. הכנת מערך בדיקה: נוגדנים, אנטיגנים, ss / dsDNA, RNA וכו ' מדולל בדיקה (ים) הריכוז המתאים המאגר הרצוי. צעד זה יכול להיות להשתנות במידה ניכרת, אבל ניסוי טיפוסי מנצל אנטיגן או IgG בריכוז של 0.5 מ"ג / מ"ל ​​(טווח של 0.1 -1 מ"ג / מ"ל) ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) ב-pH 7.4 ≈. המקום פתרונות 96 – או 384 גם צלחת (או צלחת מקור סטנדרטי עבור הצופה בשימוש) הגדרת פרמטרים תצפית עבור מערך מודפס הרצוי: לקבוע את הפרמטרים אכון מתאים השטח פתרונות בשימוש (לשכון פעמים, מהירויות גישה וכו '). לקבוע את מספר משכפל של כל תנאי לכל הרשת, פריסת הרשת, מספר רשתות לשכפל, ואת המיקום הרצוי תצפית על השבב. מצעים המקום ואת צלחת מקור במקומות המתאימים, ודא בקבוקי פסולת אספקת מוכנים, ומתחילים לרוץ ההדפסה. לאחר תצפית הוא סיים מצעים מקום בסביבת לחות גבוהה הלילה (4-18 שעות) כדי לאפשר תהליך immobilization ואת שחרור משרות כדי להמשיך. לשטוף מצעים: למקם אותם את הפתרונות הבאים במשך שלוש דקות במשך שלושה שוטף נפרדים: PBS עם Tween 0.1% (PBST), PBS, ו deionized סוף סוף (DI) מים. בהתאם לסוג הניסוי (רטוב לעומת יבש), לייבש את שבב ביסודיות עם גז ארגון ולהתחיל הדגירה או למקם את שבב בתא תזרים ולהרכיב. בטל הנותרים NHS קבוצות על פני השטח קופולימר על ידי השריית שבבי בתמיסה 50 מ"מ של ethanolamine עם pH 7.4 המותאמת במשך 30 דקות תוך כדי בצלחת שייקר. המתחם העיקרי אמין המכילים כגון hydroxylamine או טריס יכול לשמש גם, כל עוד הפתרון מוכן בטוח לשימוש עם חלבונים. לשטוף ביסודיות את הפתרון באמצעות שחרור משרות PBS מים אז די. שלב אופציונלי (תלוי בכימיה את פני השטח להיות מועסק): משטח בלוק באמצעות פתרון של BSA, קזאין, או חלב rehydrated במשך 30 דקות. עבור כימיה של פני השטח הנוכחי פולימריות כי אנו משתמשים, אנחנו לא לבצע שלב זה כמו עמוד השדרה פולימר פעולות כדי למנוע הלא ספציפית מחייב חלבון. 3. נתונים נוהל רכישה דגירה: פורמט Endpoint בצע פתרון יעד של עניין למאגר הרצוי. הנה, זה יהיה פתרון של הריכוז המתאים של Anti-BSA ב PBS (לשעבר: להפוך 1-10 מ"ל של 10 ng / mL פתרון של Anti-BSA ב PBS). כמו כן, ודא שיש כמות שווה של המאגר (ללא מטרה) עבור הדגירה הביקורת השלילית. קח מראה סיליקון לסרוק לנרמול כל הנתונים שנאספו לאחר מכן. סרוק את מערך בדיקה מוכן עם מערכת IRIS לפני שלב הדגירה כדי לקבוע את גובה אופטי הראשונית (מסה) במקום אחד. זה יאפשר ניתוח נכון של שינויים המונית על פני השטח, כלומר את רמת מחייב, לאחר דגירה. הנה כמה פרמטרים יותאם עבור הניסוי הנוכחי, כגון זמן חשיפה, שדה הראיה, תוך התמקדות משגשגת, וכו ' לצלול שבב (ים) בתמיסה מוכנה שעה 1 על צלחת שייקר. זמן הדגירה יכול להשתנות במידה ניכרת בהתאם לרמת של התססה, ריכוז היעד להתגלות, מאפייני התחבורה של התא זרימה (אם מצב בזמן אמת איתור נמצא בשימוש), את הזיקות של זוג יעד-החללית, וכו ' . לאחר דגירה, לחזור על התהליך המתואר בשלב לשטוף 2.5) סרוק את מערך בדיקה אותו באמצעות מערכת IRIS ולקבל שלאחר הדגירה תמונות להשוואה לפני הדגירה. חזור על תהליך זה עבור שלבי הדגירה שונה אם יש צורך, למשל בפורמט כריך assay שבו נוגדן משני נמצא בשימוש. 4. ניתוח נתונים התאם את התמונות שנאספו עבור כל סריקה IRIS (רצף של תמונות אינטנסיביות), באמצעות תוכנה שפותחה במעבדה הפרוהדוצ'ה דימוי של מערך בדיקה המכיל מידע עובי אופטי. ניתוח איכותי ומהיר של הכריכה יכול להתבצע על ידי הפחתת (רשום) שלאחר מראש דגירה תמונות. עקידת יופיעו כשינוי עוצמת באותם מקומות שבהם נצפו שינויים המונית. לניתוח כמותי, לקבוע צפיפות המסה של כל נקודה לעומת הרקע ידי ממוצעים מידע עובי אופטי עבור כל פיקסל בתוך נקודה ו חיצוני annulus של המקום ולעשות השוואה ישירה של שני האזורים הללו. 5. נציג תוצאות: איור 1 מציג דוגמה סכמטית את המצע שכבתית Si-IRIS SiO 2 הבחין עם מגוון נוגדנים נציג. האנסמבל כל נוגדן הוא הבחין לשכפל עם סגוליות עבור epitope שונה המיקוד חלבונים שונים. שני וירוסים שונים, כל חלבון נגיפי מיוצגים מטרות למשל. נוגדנים שליטה שלילי תלוי assay וניתן הלא ספציפית ו / או וירוס ספציפי. איור 2 מראה את הכריכה של אלבומין בסרום אדם (HSA) נוגדנים ספציפיים למערך של הבחין HSA ו הארנב IgG (שליטה) כתמים. כפי שניתן לראות כאן, לאחר הולם וקביעת האופטי עוביים של תמונות לפני ואחרי, דגירה, התמונה את ההבדל עבור מערך מחייב ניתן ליצור איכותית להעריך מחייב. ניתוח כמותי מגלה כי 2.05 ו – 0.13 ננומטר מתכוון לשנות את גובה אופטי נצפתה עבור HSA ו IgG ארנבת נקודות, בהתאמה, עבור ריכוז אנטי HSA דגירה של 500 ng / mL. איור 3 מראה מדידה IRIS התלות פרווה חלבון מחייב ריכוז חלבון באורך dsDNA oligomer. הגרף למעלה מראה מוחלט מדידות גובה אופטי הראשוני משותק בדיקה לגבהים oligomer שלאחר הדגירה מחייב פרווה. הגדלת הריכוזים של פרווה (50, 100, 200 ננומטר) הביא מחייב עלה ל בדיקות דנ"א. אורכו של oligomers גם משפיע מחייב פרווה עם רצפים יותר וכתוצאה מכך מחייב יותר. הנה, ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן אחת מן הממוצע. העלילה התחתונה מראה מחושב חלבון פרווה dimer מחייב לכל גדיל dsDNA. דימר מחייב הוגדל משמעותית בריכוז החלבון פרווה של 200 ננומטר המצביע על רמה גבוהה של הכריכה הלא ספציפית. באיור 1. סכמטי של מערך דוגמה בדיקה משמש בדרך כלל בניסוי לגילוי וירוסים ספציפיים מרכיבים נגיפיים באופן multiplexed עם מערכת IRIS. איור 2. Post-הדגירה תמונה ההבדל עבור המחייב של האדם אלבומין בסרום נוגדנים ספציפיים כדי הבחין HSA שנאספו במערכת ללא תווית זו בריכוז של 500 ng / mL. צפיפות המסה ביולוגי עבור כל נקודה נקבע לפי ממוצע של מידע עובי אופטי בתוך נקודה ואז להשוות את זה עם ממוצע של annulus סביב המקום המייצג את הרקע. איור 3. מגרש של נתונים מחייב חלבון אינטראקציות עם פרווה הבחין פעמיים תקועים oligomers עם רצף קונצנזוס ידוע מבוסס על אורך oligomer, מיקומו של רצף קונצנזוס בתוך oligomer, ואת ריכוז החלבון פרווה. מידע על הסכום המוחלט של חלבון פרווה מחויב כל רצף הבחין (למעלה) ניתן להשתמש כדי להעריך את מספר הדימרים פרווה מחויב כל סוג של oligomer (התחתון).

Discussion

הפלטפורמה IRIS היא מערכת פשוטה ומהירה לשימוש לאיסוף תפוקה גבוהה הנתונים המחייבים בפורמט microarray. עד קוולנטית משתק שונה בדיקות תפקודי חלבון או דנ"א על ​​משטח, אנטיגנים יעד / סמנים ביולוגיים / וכו '. ניתן ללכוד מן הפתרון, כמו immunoassay. מדידה של האינטראקציות הללו על תנאי בדיקה נקודת הסיום או בזמן אמת פורמט עם מערכת IRIS מאפשרת למידע רגיש מאוד כמותי להיות שנאספו במשך כל האינטראקציה. הניסוי נציג מפורט כאן הוא רק דוגמה אחת של סוגי אינטראקציות כי ניתן ללמוד עם טכניקה זו. איתור של גורמי שעתוק, אנטיגנים נגיפיים, ווירוסים כל הודגמה בעבר מייצג רק כמה דוגמאות של סוגי ניתוחים כי IRIS יכול לטפל בקלות.

Materials

1. Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide, Silicon Valley Microelectronics, custom order
2. Ammonium sulfate powder, Sigma-Aldrich cat. # A5132
3. Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate, Fisher Scientific cat. # BP665-1
4. Antibody to human serum albumin (Anti-HSA), Sigma-Aldrich cat. # A0433
5. Human serum albumin (HSA), Sigma-Aldrich cat. # A9511
6. Argon or nitrogen gas (ultra-high purity), Airgas cat. # AR UHP300 or # NI UHP300
7. Petri dishes, 60 mm x 15 mm, Fisher Scientific cat. # 0875713A
8. Scienceware® vacuum desiccator, Sigma-Aldrich cat. # Z119016
9. Microcentrifuge tubes, Fisher Scientific cat. # 05-408-120
10. 96-well plates, low cell binding, Nalgene Nunc International cat. # 145399
11. BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer, Bio-Rad
12. Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379
13. Ethanolamine, Sigma-Aldrich # 398136
14. Hydroxylamine, Thermo Scientific cat. # 26103
15. Multi-purpose rotator, Thermo Scientific (Barnstead International), model # 2314, cat. # 2314Q
16. Retiga 2000R camera, QImaging cat. # 01-RET-2000R-F-M-12
17. AcuLED illumination source, PerkinElmer, custom order
18. Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.), Thorlabs