Биомолекулярных Обнаружение использованием интерферометрических датчиков изображения отражения (IRIS)

Summary

Количественный, высокой пропускной способности в режиме реального времени и без наклеек обнаружения биомолекул (ДНК, белки и др.) на SiO₂ Поверхностях можно добиться, используя простую технику интерферометрических которая опирается на светодиодной подсветки, минимальный оптических компонентов, а также камеры. Интерферометрические датчика изображения отражения (ИРИС) является недорогим, простым в использовании, и поддаются микрочипов форматов.

Abstract

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, environmental/agricultural/biodefense monitoring, nanobiotechnology, and more. For diagnostic applications, monitoring (detecting) the presence, absence, or abnormal expression of targeted proteomic or genomic biomarkers found in patient samples can be used to determine treatment approaches or therapy efficacy. In the research arena, information on molecular affinities and specificities are useful for fully characterizing the systems under investigation.

Many of the current systems employed to determine molecular concentrations or affinities rely on the use of labels. Examples of these systems include immunoassays such as the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), polymerase chain reaction (PCR) techniques, gel electrophoresis assays, and mass spectrometry (MS). Generally, these labels are fluorescent, radiological, or colorimetric in nature and are directly or indirectly attached to the molecular target of interest. Though the use of labels is widely accepted and has some benefits, there are drawbacks which are stimulating the development of new label-free methods for measuring these interactions. These drawbacks include practical facets such as increased assay cost, reagent lifespan and usability, storage and safety concerns, wasted time and effort in labelling, and variability among the different reagents due to the labelling processes or labels themselves. On a scientific research basis, the use of these labels can also introduce difficulties such as concerns with effects on protein functionality/structure due to the presence of the attached labels and the inability to directly measure the interactions in real time.

Presented here is the use of a new label-free optical biosensor that is amenable to microarray studies, termed the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS), for detecting proteins, DNA, antigenic material, whole pathogens (virions) and other biological material. The IRIS system has been demonstrated to have high sensitivity, precision, and reproducibility for different biomolecular interactions [1-3]. Benefits include multiplex imaging capacity, real time and endpoint measurement capabilities, and other high-throughput attributes such as reduced reagent consumption and a reduction in assay times. Additionally, the IRIS platform is simple to use, requires inexpensive equipment, and utilizes silicon-based solid phase assay components making it compatible with many contemporary surface chemistry approaches.

Here, we present the use of the IRIS system from preparation of probe arrays to incubation and measurement of target binding to analysis of the results in an endpoint format. The model system will be the capture of target antibodies which are specific for human serum albumin (HSA) on HSA-spotted substrates.

Protocol

1. Подготовка основания Пальто слоистых кремния SiO 2 субстратов с само-адсорбирующих сополимеры (DMA-NAS-MAPS): Сополимер синтеза, химической структуре, и процесс покрытия опубликованы в: Г. Pirri, Ф. Дамин, М. Киари, Е. Bontempi, Л. Деперо. Характеристика полимерных покрытий для адсорбированных Слайды ДНК-микрочипов стекла. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-58. Короче говоря, готовить раствор полимера, добавив 100 мг полимера до 5 мл деионизированной (DI) воду и добавьте 5 мл 40% насыщенного сульфата аммония ((NH 4) 2SO 4) решение для достижения конечной концентрации 0,92 М. Погрузите чипов в растворе в течение 30 минут на шейкере, а затем тщательно промыть водой DI. Сухой тщательно Аргон / N 2 газа. Выпекать чипов при 80 ° С в течение 15 мин. Магазин с полимерным покрытием подложки / фишки в сухой среде (вакуум эксикаторе) на срок до 3 месяцев, пока зонд кровянистые выделения процедуры. 2. Подготовка зонда Array: антитела, антигены, сс / двухцепочечной ДНК, РНК и т.д. Развести зонд (ы) в соответствующие концентрации в нужном буфере. Этот шаг может быть значительно различаются, но типичном эксперименте используется антиген или IgG в концентрации 0,5 мг / мл (диапазон от 0,1 -1 мг / мл) в фосфатном буферном растворе (PBS) при рН ≈ 7,4. Место решения в 96 – или 384-луночного планшета (или стандартного пластины источника корректировщик используется) Установка кровянистые выделения параметры желаемого печатного массива: определить соответствующие кровянистые выделения параметров поверхности и решений используется (продолжительность, скорость приближения и т.д.). Определить количество повторов каждого условия в сетку, сетку макета, число повторить сетки и желаемой кровянистые выделения места на чипе. Место подложки и источника пластины в соответствующих местах, проверить, чтобы убедиться, бутылки отходов и предложения готовы, и начать печать перспективе. После завершения кровянистые выделения места субстратов в условиях высокой влажности ночь (4-18 часов), чтобы позволить иммобилизации и процесс дезактивации для продолжения. Вымойте основания: поместите их в следующие решения в течение трех минут для трех отдельных моет: PBS с 0,1% Tween (PBST), PBS, и, наконец, деионизированной (DI) воде. В зависимости от типа эксперимента (мокрый по сравнению с сухими), сухой чип полностью с газом аргоном и начать инкубации или место чип в проточную камеру и собрать. Отключите остальные NHS групп на поверхности сополимера, погружая чипов в 50 мМ раствора этаноламина с рН до 7,4 в течение 30 минут, пока на тарелке шейкер. Первичный амин-содержащего соединения, такие как гидроксиламин или Трис также могут быть использованы до тех пор, приготовленный раствор можно безопасно использовать с белками. Тщательно промойте дезактивации решения с использованием PBS то DI воды. Дополнительный шаг (в зависимости от химического состава поверхностных получить работу): Блок поверхности с помощью раствора BSA, казеин, молоко или регидратации в течение 30 минут. Для текущего полимерной химии поверхности, которые мы используем, мы не выполнять этот шаг как цепи полимера актов для предотвращения неспецифического связывания с белками. 3. Устройства сбора данных и инкубации Процедура: Endpoint формате Сделать решения целевой интерес в нужном буфере. Вот, это будет решением соответствующей концентрации анти-BSA в PBS (например: сделать 1-10 мл 10 нг / мл раствора по борьбе с BSA в PBS). Кроме того, убедитесь, что эквивалентное количество буфера (без цели) для отрицательного контроля инкубации. Возьмите сканирования кремния зеркало для нормализации всех Впоследствии собранные данные. Сканирование подготовлены массив зонд с системой IRIS до инкубации для определения начальной оптической высоте (массы) на каждом месте. Это позволит обеспечить надлежащий анализ изменений в массу на поверхность, т. е. уровень связывания после инкубации. Здесь несколько параметров будут скорректированы для текущего эксперимента, таких как время экспозиции, поле зрения, процветающей фокусировки, и т.д. Погрузите чип (ы) в приготовленный раствор в течение 1 часа на тарелку шейкер. Инкубационный период может значительно изменяться в зависимости от уровня возбуждения, концентрации целевого обнаружения, транспортных характеристик проточную камеру (если в режиме реального времени обнаружения режиме используется), общность целевой зонда пару, и т.д. . После инкубации, повторите процедуру промывания, описанных в пункте 2.5) Сканирование одного массива зонда с помощью системы IRIS и получить после инкубации изображений для предварительной инкубации сравнения. Повторите этот процесс для различных этапов инкубации при необходимости, например, в формате сэндвич анализа, где вторичные антитела используются. 4. Анализ данных Fit собраны изображения для каждого IRIS сканирования (последовательность интенсивность изображения), с использованием лабораторного разработали программное обеспечение, чтобы проДуче образ зонд массив, содержащий информацию оптические толщины. Быстрый качественный анализ связывания могут быть выполнены путем вычитания (зарегистрированных) пост-и пре-инкубации изображений. Привязка будет выглядеть как изменение интенсивности в тех местах, где масса изменений не наблюдалось. Для количественного анализа, определения плотности массы каждое пятно по сравнению с фоном в результате усреднения оптической информации толщины для каждого пикселя в пределах пятна и кольца за пределами места и сделать прямое сравнение этих двух областях. 5. Представитель Результаты: На рисунке 1 показан пример Схема слоистой Si-SiO 2 IRIS подложки пятнистый с представителем массив антител. Каждое антитело ансамбля замечены в репликацию с специфичность для различных эпитопа предназначенные для разных белков. Два разных целом вирусов и вирусных белков представлены в качестве примера целей. Отрицательный контроль антител зависит от анализа и может быть неспецифическим и / или конкретного вируса. На рисунке 2 показан связывания сывороточного альбумина человека (HSA)-специфических антител к множество пятнистых HSA и кролика IgG (контроля) пятна. Как видно здесь, после установки и определение оптических толщин для пред-и пост-инкубации изображений, разница на изображение для обязательного Массив может быть создан с целью качественного анализа связывания. Количественный анализ показывает, что 2,05 и 0,13 нанометра средняя оптическая изменение высоты наблюдалась HSA и кролика IgG пятна, соответственно, для анти-HSA инкубации концентрации 500 нг / мл. На рисунке 3 показана измерения IRIS меха связывания с белками зависимости от концентрации белка и двухцепочечной ДНК олигомеров длины. Верхний график показывает абсолютные оптические измерения высоты для первоначальной иммобилизованных олигомер датчик высоты и после инкубации меха обязательными. Повышение концентрации меха (50, 100, 200 нм) приводит к увеличению связывания с ДНК-зондов. Длина олигомеры также влияет на связывание с мехом длинных последовательностей в результате чего более обязательными. Здесь, погрешности представляют собой одно стандартное отклонение от среднего значения. Нижний график показывает, рассчитанные димера меха связывания с белками на каждый блок двухцепочечной ДНК. Димер обязательной была значительно увеличена при концентрации меха белка в 200 Нм, что свидетельствует о высоком уровне неспецифического связывания. Рисунок 1. Схема пример массива зонд, обычно используемых в эксперименте для обнаружения специфических вирусов и вирусных компонентов в мультиплексированных моды с системой IRIS. Рисунок 2. После инкубации разница изображение для связывания сывороточного альбумина человека-специфических антител к пятнистой HSA собранных с этим ярлыком, свободной системы в концентрации 500 нг / мл. Плотность биоматериала массы для каждого пятна определяется путем усреднения оптической информации толщина в месте, а затем сравнивая это с среднем кольце вокруг пятна представляют фоне. Рисунок 3. Участок связывания данных для меха белковых взаимодействий с пятнистой двухцепочечной олигомеров с известными консенсусной последовательности на основе олигомер длина, расположение консенсусной последовательности в олигомер, и концентрация меха белка. Информация об абсолютной сумме меха белка связаны друг с последовательностью пятнистый (вверху) может быть использована для оценки числа меха димеры связаны друг с типом олигомер (внизу).

Discussion

Платформа IRIS является простая и быстрая система будет использоваться для сбора высокой пропускной привязки данных в формате микрочипов. По ковалентно иммобилизации различных функциональных проб белка или ДНК на поверхности, целевых антигенов / биомаркеров / и т.д.. могут быть захвачены из раствора, как и в иммуноанализа. Измерение этих взаимодействий между зондом условия в конечной точке или в режиме реального времени формата с системой IRIS позволяет очень чувствительны и количественной информации должны быть собраны для каждого взаимодействия. Представитель эксперимента подробно описаны здесь лишь один пример из видов взаимодействий, которые могут быть изучены с этой техникой. Выявление факторов транскрипции, вирусные антигены, и целые вирусы было продемонстрировано ранее, и представляет собой лишь несколько примеров из видов анализа, что IRIS может легко справиться.

Materials

1. Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide, Silicon Valley Microelectronics, custom order
2. Ammonium sulfate powder, Sigma-Aldrich cat. # A5132
3. Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate, Fisher Scientific cat. # BP665-1
4. Antibody to human serum albumin (Anti-HSA), Sigma-Aldrich cat. # A0433
5. Human serum albumin (HSA), Sigma-Aldrich cat. # A9511
6. Argon or nitrogen gas (ultra-high purity), Airgas cat. # AR UHP300 or # NI UHP300
7. Petri dishes, 60 mm x 15 mm, Fisher Scientific cat. # 0875713A
8. Scienceware® vacuum desiccator, Sigma-Aldrich cat. # Z119016
9. Microcentrifuge tubes, Fisher Scientific cat. # 05-408-120
10. 96-well plates, low cell binding, Nalgene Nunc International cat. # 145399
11. BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer, Bio-Rad
12. Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379
13. Ethanolamine, Sigma-Aldrich # 398136
14. Hydroxylamine, Thermo Scientific cat. # 26103
15. Multi-purpose rotator, Thermo Scientific (Barnstead International), model # 2314, cat. # 2314Q
16. Retiga 2000R camera, QImaging cat. # 01-RET-2000R-F-M-12
17. AcuLED illumination source, PerkinElmer, custom order
18. Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.), Thorlabs