Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in Xenopus Ectoderm in reactie op Wnt signalering
Summary
Xenopus embryonale ectoderm is uitgegroeid tot een aantrekkelijk model voor onderzoek van de cel polariteit. Een test wordt beschreven, waarin de subcellulaire distributie van fluorescerende eiwitten wordt beoordeeld in het ectoderm cellen. Dit protocol zal helpen met vragen met betrekking tot ruimtelijke controle van de signalering.
Abstract
Celpolariteit is een fundamentele eigenschap van eukaryote cellen die dynamisch wordt door zowel intrinsieke en extrinsieke factoren gereguleerd tijdens de embryonale ontwikkeling 1, 2. Een van de signaalwegen betrokken bij deze verordening is de Wnt-route, die vele malen wordt gebruikt tijdens embryogenese en van cruciaal belang voor de mens de ziekte van 3, 4, 5. Meerdere moleculaire componenten van deze route coördinerend regelen signalering in een ruimtelijk-beperkte wijze, maar de onderliggende mechanismen zijn nog niet volledig begrepen. Xenopus embryo epitheliale cellen is een uitstekend systeem om subcellulaire lokalisatie van de verschillende signaleringeiwitten te bestuderen. TL-fusie-eiwitten worden uitgedrukt in Xenopus embryo's door RNA micro-injectie, zijn ectodermale explantaten voorbereid en eiwit lokalisatie wordt geëvalueerd door epifluorescentie. In deze experimentele protocol beschrijven we hoe de subcellulaire lokalisatie van Diversin, een cytoplasmatisch eiwit dat is betrokken bij signalering en celpolariteit vastberadenheid 6, 7 wordt gevisualiseerd in Xenopus ectodermale cellen Wnt signaaltransductie 8 te bestuderen. Co-expressie van een Wnt-ligand of een Frizzled receptor verandert de verdeling van de Diversin gefuseerd met rood fluorescerend eiwit, RFP en rekruten aan de celmembraan in een gepolariseerde mode 8, 9. Deze ex vivo protocol moet een nuttige aanvulling op in-vitro-studies van gekweekte zoogdiercellen, waarin ruimtelijke controle van signalering verschilt van die van de intacte weefsel en is veel moeilijker te analyseren is.
Protocol
Discussion
We hebben de boven-protocol om de subcellulaire lokalisatie van Diversin karakteriseren. In dierproeven pole explantaten, was Diversin-RFP naast de kern ontdekt en colocalized met g-tubuline, een centrosomal marker, in vriescoupes (figuur 1). Zodra de subcellulaire lokalisatie van een eiwit is geïdentificeerd, kan verwijdering constructen gegenereerd worden om vast te stellen welk eiwit-domeinen zijn noodzakelijk en voldoende voor de subcellulaire lokalisatie. Met behulp van deze aanpak zijn de centrosomal lokalisatie …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in het Sokol laboratorium is gesponsord door de Nationale instituten of Health.
References
- Gurdon, J. B. Embryonic induction — molecular aspects. Development. 99, 285-306 (1987).
- Moody, S. A. . Principles of Developmental Genetics. , (2007).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Gordon, M. D., Nusse, R. Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors. J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).
- Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling. Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).
- Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).
- Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling. J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).
- Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development. Mech Dev. 74, 145-157 (1998).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30, 675-686 (1982).
- Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling. J Biol. 4, 3-3 (2005).
