Traslocazione polarizzato di proteine fluorescenti in Xenopus in risposta alla segnalazione Wnt
Summary
Xenopus ectoderma embrionale è diventato un modello attraente per gli studi di polarità cellulare. Un saggio è descritta, in cui la distribuzione subcellulare delle proteine fluorescenti è valutata in cellule ectoderma. Questo protocollo aiuterà a trattare questioni relative al controllo spaziale della segnalazione.
Abstract
Polarità delle cellule è una proprietà fondamentale delle cellule eucariotiche che viene dinamicamente regolato da fattori intrinseci ed estrinseci, sia durante lo sviluppo embrionale 1, 2. Una delle vie di segnalazione coinvolte nel presente regolamento è la via Wnt, che viene utilizzato più volte durante l'embriogenesi e critica per la malattia umana 3, 4, 5. Molteplici componenti molecolari di questa via di segnalazione coordinatamente regolano in maniera spazialmente limitato, ma i meccanismi alla base non sono pienamente compresi. Xenopus cellule embrionali epiteliali è un ottimo sistema per studiare la localizzazione subcellulare delle diverse proteine di segnalazione. Proteine di fusione fluorescenti sono espressi in embrioni di Xenopus da microiniezione di RNA, gli espianti ectodermiche sono preparati e la localizzazione delle proteine viene valutato epifluorescenza. In questo protocollo sperimentale descriviamo come localizzazione subcellulare di Diversin, una proteina citoplasmatica che è stato implicato nella segnalazione e polarità determinazione delle cellule 6, 7 viene visualizzato in Xenopus cellule ectodermiche per lo studio di trasduzione del segnale Wnt 8. Coespressione di un ligando Wnt o un recettore Frizzled altera la distribuzione di Diversin fuse con il rosso proteina fluorescente, RFP, e reclute alla membrana cellulare in maniera polarizzata 8, 9. Questo protocollo ex vivo dovrebbe essere un'utile aggiunta a studi in vitro su colture di cellule di mammifero, in cui il controllo spaziale del segnale è diversa da quella del tessuto intatto ed è molto più difficile da analizzare.
Protocol
Discussion
Abbiamo usato il protocollo di cui sopra per caratterizzare la localizzazione subcellulare di Diversin. In espianti polo animale, Diversin-RFP è stata rilevata accanto al nucleo e colocalized con g-tubulina, un marker centrosomica, in criosezioni (Figura 1). Una volta che la localizzazione subcellulare di una proteina è identificato, costruisce la cancellazione può essere generata per stabilire quali domini di proteine sono necessarie e sufficienti per la localizzazione subcellulare. Usando questo approccio, i …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca nel laboratorio Sokol è patrocinata dal Institues Nazionale di Salute.
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