Xenopus эмбриональной эктодермы стала привлекательной моделью для исследования клеточной полярности. Анализа описывается, в котором субклеточных распределение флуоресцентных белков оценивается в эктодермы клеток. Этот протокол поможет решить вопросы, связанные с пространственным управления сигнализацией.
Abstract
Сотовые полярность фундаментальное свойство клеток эукариот, который динамически регулируется как внутренних и внешних факторов во время эмбрионального развития 1, 2. Один из сигнальных путей, участвующих в этом регулирование Wnt путь, который используется во много раз во время эмбриогенеза и критические для человека болезнь 3, 4, 5. Множественные молекулярные компоненты этого пути согласованно регулировать сигнализации в пространственно-ограниченной форме, но основные механизмы, полностью не поняты. Xenopus эмбриональных эпителиальных клеток является отличной системой для изучения субклеточных локализации различных сигнальных белков. Флуоресцентные белки слияния выражены у эмбрионов Xenopus путем микроинъекции РНК, эктодермального эксплантов готовятся и локализации белка оценивается epifluorescence. В этом протоколе исследования мы описываем, как субклеточные локализации Diversin, цитоплазматических белков, которые были причастны к сигнализации и клеточной полярности определения 6, 7 визуализируется в Xenopus эктодермальных клеток для изучения передачи сигналов Wnt 8. Коэкспрессия Wnt лиганда или Frizzled рецепторов изменяет распределение Diversin сливается с красного флуоресцентного белка, ППП, и новобранцы его клеточную мембрану в поляризованной моды 8, 9. Это бывший протокол естественных условиях должно быть полезным дополнением к лабораторные исследования в культивируемых клетках млекопитающих, в котором пространственные контроль сигнализации отличается от неповрежденной ткани и является гораздо более трудной для анализа.
Protocol
1. Экстракорпоральное оплодотворение яйца из Xenopus Получить яйца самка лягушки, которые вводили хорионический гонадотропин человека (400 ед / лягушка) 12 часов до эксперимента. Место яйца в небольшом количестве (0,5-1 мл) на 1 изменение х Марка раствор Рингера (MMR) 10 к ?…
Discussion
Мы использовали выше протокол, чтобы охарактеризовать субклеточные локализации Diversin. В эксплантатах животных полюса, Diversin-ППП был обнаружен рядом с ядром и colocalized с г-тубулина, centrosomal маркер, в cryosections (рис. 1). После субклеточные локализации белка определяется, удаление конструкции могут…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в лаборатории Сокол спонсируется Национальным Institues здравоохранения.
Itoh, K., Sokol, S. Y. Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling. J. Vis. Exp. (51), e2700, doi:10.3791/2700 (2011).