の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉
Summary
アフリカツメガエル胚の外胚葉は、細胞極性の研究のための魅力的なモデルとなっている。アッセイは、蛍光タンパク質の細胞内分布は、外胚葉の細胞で評価されている、説明しています。このプロトコルは、シグナリングの空間的な制御に関連したアドレスの質問に役立ちます。
Abstract
細胞極性は、動的に胚発生1、2の間の内部外部の両方の要因によって調節されている真核細胞の基本的なプロパティです。この調節に関与するシグナル伝達経路の一つは、胚発生やヒト疾患3、4、5の重要な中に何度も使用されているWnt経路、である。この経路の複数の分子成分が協調的空間的に制限された方法で、シグナル伝達調節し、しかし根本的なメカニズムは完全には解明されていません。 ツメガエル胚上皮細胞は、様々なシグナル伝達タンパク質の細胞内局在を研究する優れたシステムです。蛍光融合タンパク質がRNAのマイクロインジェクションによるアフリカツメガエルの胚で発現され、外胚葉外植片を調製し、タンパク質の局在は、落射蛍光で評価されます。この実験的なプロトコルでは、Diversin、シグナリングと細胞極性の決定6、7に関与している細胞質タンパク質の細胞内局在がWntシグナル伝達8を研究するためにアフリカツメガエルの外胚葉細胞の視覚化方法について説明します。 Wntリガンドまたはフリッツルド受容体の共発現は、赤色蛍光タンパク質、RFPとの融合Diversinの分布を変化させる、と偏ファッション8,9の細胞膜に募集しています。この生体外でのプロトコルは、シグナリングの空間的な制御が無傷組織のものと異なっているとはるかに難しい分析することになっている哺乳動物培養細胞、のin vitro試験に役立つだけでなくでなければなりません。
Protocol
Discussion
我々はDiversinの細胞内局在性を特徴づけるために、上記のプロトコルを使用している。動物極の外植片、Diversin – RFPで、核に隣接し、凍結切片（図1）におけるG -チューブリン、中心体マーカーとの共局在が検出されました。タンパク質の細胞内局在が識別されると、削除の構造は、蛋白質のドメインが必要と細胞内局在のために十分であるか確立するために生成することができます。このア?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ソコル実験室での研究は米国立衛生Instituesが主催しています。
References
- Gurdon, J. B. Embryonic induction — molecular aspects. Development. 99, 285-306 (1987).
- Moody, S. A. . Principles of Developmental Genetics. , (2007).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Gordon, M. D., Nusse, R. Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors. J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).
- Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling. Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).
- Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).
- Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling. J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).
- Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development. Mech Dev. 74, 145-157 (1998).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30, 675-686 (1982).
- Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling. J Biol. 4, 3-3 (2005).
