सी. में vivo लेजर Axotomy में एलिगेंस
Summary
एक प्रोटोकॉल में न्यूरॉन्स में कटौती<em> सी. एलिगेंस</em> के साथ एक MicroPoint स्पंदित लेजर प्रस्तुत किया है. हम प्रणाली स्थापित करने का वर्णन है, कीड़े immobilizing, और लेबल न्यूरॉन्स विच्छेद. लाभ एक अपेक्षाकृत कम लागत प्रणाली और neuronal प्रक्रियाओं या ablate कोशिकाओं को तोड़ करने की क्षमता शामिल<em> Vivo में</em>.
Abstract
न्यूरॉन्स axons और dendrites, जिनमें पूर्व या बाद synaptic विशेषज्ञताओं पतला झिल्ली एक्सटेंशन के माध्यम से अन्य कोशिकाओं के साथ संवाद. यदि एक न्यूरॉन चोट या बीमारी से क्षतिग्रस्त है, यह पुनर्जन्म हो सकता है. सेल आंतरिक और बाह्य कारकों के प्रभाव एक न्यूरॉन की क्षमता को पुनर्जीवित करने के लिए और समारोह बहाल. हाल ही में, निमेटोड सी एलिगेंस एक उत्कृष्ट मॉडल जीव के रूप में उभरा है जीन की पहचान और रास्ते में है कि 1-6 न्यूरॉन्स के उत्थान के प्रभाव संकेत है. मुख्य सी. में neuronal उत्थान आरंभ एलिगेंस लेजर की मध्यस्थता काटने, या axotomy है. Axotomy के दौरान, एक fluorescently लेबल neuronal प्रक्रिया उच्च ऊर्जा दालों का उपयोग करने के लिए कटे है. प्रारंभ में, सी. में neuronal उत्थान एलिगेंस एक प्रवर्धित femtosecond 5 लेजर का उपयोग कर जांच की गई थी. हालांकि, बाद उत्थान अध्ययनों से पता चला है कि एक पारंपरिक लेजर स्पंदित करने के लिए सही vivo में न्यूरॉन्स को तोड़ने और एक समान पुनर्योजी 1,3,7 प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हम MicroPoint स्पंदित लेजर, एक वर्तकुंजी प्रणाली है कि आसानी से उपलब्ध है और है कि व्यापक रूप से किया गया है लक्षित सेल पृथक के लिए इस्तेमाल किया प्रयोग कीड़ा में vivo लेजर axotomy में प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम लेजर aligning वर्णन, कीड़े बढ़ते विशिष्ट न्यूरॉन्स काटने, और बाद उत्थान का आकलन. प्रणाली के लिए एक प्रयोग के दौरान कई कीड़े में न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या में कटौती करने की क्षमता प्रदान करता है. इस प्रकार, लेजर के रूप में इस के साथ साथ वर्णित axotomy उत्थान की प्रक्रिया की शुरुआत और विश्लेषण के लिए एक कुशल प्रणाली है.
Protocol
Discussion
लेजर प्रणालियों की एक किस्म neurites के लिए सी में कटौती के लिए इस्तेमाल किया गया है एलिगेंस, और कई अध्ययनों 3,7,10,11 विस्तार में उनके प्रदर्शन की जांच की है. MicroPoint हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया लेजर एक वर्तकुंजी प्रणाली है कि स्थापित करने और बनाए रखने के लिए आसान है, और तिवारी नीलम लेजर प्रणाली की तुलना में शोधकर्ताओं के लिए एक कम कीमत पर उपलब्ध है. तिवारी नीलम प्रणाली की तुलना में, तथापि, MicroPoint लेजर एक बड़ा क्षेत्र है, जो कुछ अनुप्रयोगों के लिए हानिकर हो सकता है नुकसान के कारण की उम्मीद है. यदि तिवारी नीलम प्रणाली वांछित है, एक ऐसी प्रणाली के निर्माण पर एक उत्कृष्ट प्रोटोकॉल उपलब्ध है 12.
वर्तमान प्रोटोकॉल सी. में न्यूरॉन्स की एक किस्म पर प्रदर्शन किया जा सकता है है एलिगेंस, तथापि, हम ध्यान दें कि न्यूरॉन्स के विशिष्ट प्रकार के बीच पुनर्योजी क्षमताओं में मतभेद 13 की उम्मीद कर रहे हैं . इसके अतिरिक्त, विभिन्न ट्रांसजेनिक पृष्ठभूमि पुनर्योजी सफलता को प्रभावित कर सकते हैं. हालांकि regenerating GABA न्यूरॉन्स के प्रतिशत अलग ट्रांसजेनिक मार्कर उपभेदों के बीच काफी संगत है, हम 14 juIs76 में एक समग्र oxIs12 15 कीड़े बनाम उत्थान में मामूली वृद्धि का उल्लेख किया है. स्पर्श न्यूरॉन्स के मार्कर के बीच अंतर भी 2 वर्णित किया गया है.
हम anesthetics के बजाय microbeads के साथ कीड़े स्थिर पसंद के रूप में मोती तेजी से और अधिक सुसंगत 16 स्थिरीकरण में परिणाम . यह भी है फायदेमंद के रूप में हम किसी भी संभव confounding 17 संज्ञाहरण के कारण प्रभाव से मुक्त उत्थान निरीक्षण कर रहे हैं. स्थिरीकरण के लिए एक वैकल्पिक तरीका संवेदनाहारी मुक्त microfluidic उपकरणों का उपयोग है. axotomy के लिए microfluidics का उपयोग बड़े पैमाने पर 17-22 में वर्णित किया गया है.
हम पाते हैं कि लगातार उपयोग के साथ, सबसे अच्छा लेजर कार्यों जब Coumarin डाई सेल में 440 बार प्रत्येक सप्ताह MicroPoint के मैनुअल में उल्लिखित प्रक्रिया का पालन करने के लिए बदल जाता है. यदि आवश्यक हो, क्षीणन स्लाइडर शक्ति में वृद्धि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस पुराने डाई या लेजर misalignment के एक संकेत हो सकता है. इसके अलावा, डाई सेल एक सीमित जीवनकाल है और अंततः पुनर्निर्माण हो या जगह (देखें विघ्ननिवारण) की आवश्यकता होगी.
यह मुश्किल हो क्रॉसहेयर है कि लेजर ध्यान केंद्रित निशान के तहत लक्ष्य neurite पैंतरेबाज़ी कर सकते हैं, खासकर अगर पशु अधूरे झोले के मारे हुए है. हम पाते हैं कि इस उद्देश्य के लिए एक मैनुअल मंच इष्टतम नहीं है, हालांकि यह निश्चित रूप से प्रयोग करने योग्य है. एक जोस्टिक नियंत्रित motorized मंच और अधिक सटीक है, और हम पाते हैं कि सॉफ्टवेयर है कि motorized मंच को स्थानांतरित करने के लिए माउस के साथ घसीट छवि का समर्थन करता है का उपयोग सबसे अच्छा है. Nikon तत्वों को इस सुविधा प्रदान करता है और इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, लेकिन मुक्त Micromanager पैकेज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य इमेजिंग सॉफ्टवेयर, इसी तरह की कार्यक्षमता हो सकता है. ठीक लक्ष्यीकरण का एक अलग तरीका लेजर ध्यान केंद्रित करने के लिए पशु बजाय कदम है. एक galvanometer बीम स्टीयरिंग तंत्र के रूप में उपलब्ध है एक MicroPoint लेजर पर जोड़ने के लिए, यदि इस दृष्टिकोण पसंद है.
Neuronal उत्थान के अध्ययन के लिए अपने आवेदन के अलावा, लेजर अन्य प्रकार सेल, जैसे त्वचा, मांसपेशियों, या विशेष कोशिकाओं के रूप में ablate, या विशिष्ट neuronal synapses बाधित 23-27 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, मार्ग है कि न्यूरॉन्स के अध: पतन है कि चोट या रोग के साथ जुडा हुआ को विनियमित इस प्रणाली के साथ जांच की जा सकता है. जैसे, स्पंदित लेसरों का उपयोग करने के लिए दोनों आनुवंशिक कारकों और सेल जैविक परिवर्तन है कि neuronal उत्थान और अन्य प्रासंगिक प्रक्रियाओं की सुविधा पर प्रकाश डाला जारी रहेगा.
समस्या निवारण:
यहाँ वर्णित कुछ आम समस्याओं और उनके संबद्ध समाधान कर रहे हैं.
- लेजर ठीक से नहीं काट रहा है. यह संभावना है, क्योंकि या तो लेजर ध्यान से बाहर है (खंड 2 देखें), या डाई सेल में डाई (MicroPoint पुस्तिका देखें) जगह की जरूरत है. वैकल्पिक रूप से, डाई सेल जगह या पुनर्निर्माण की आवश्यकता हो सकती है.
- कीड़े agarose पैड पर आगे बढ़ रहे हैं. यह आम तौर पर एक संकेत है कि agarose पैड भी नम है. हम पाते हैं कि पैड के लिए लगभग 30 सेकंड के लिए छोड़ दिया से पहले कीड़े उन पर रखा जाता है इस समस्या को दरकिनार की जरूरत है. आप भी छोटे आकार microbeads (0.05 सुक्ष्ममापी) का उपयोग करने की कोशिश कर सकते हैं.
- कीड़े की वसूली मुश्किल और अक्षम है. यह गलत coverslip हटाने के द्वारा या एक सूखी agarose पैड द्वारा कारण हो सकता है है. यदि पैड भी सूखा है, तो आप देख सकते हैं कि axons एक मनके उपस्थिति विकसित. कुछ मामलों में, यह है क्योंकि कीड़े पैड पर जल्द ही पर्याप्त नहीं रखा गया, के बाद इसे बनाया गया था. वैकल्पिक रूप से, agarose समाधान के एक पुराने स्टॉक दोहराया पिघलने के बाद एक अधिक से अधिक 3% एकाग्रता हो सकता है.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hammarlund प्रयोगशाला में कार्य द्वारा वित्त पोषित है: NIH अनुदान R01 NS066082-01 और T32GM007223, Beckman फाउंडेशन, और एलिसन मेडिकल फाउंडेशन.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 0.05 μm Polystyrene Beads | Polysciences, Inc. | 08691 | |
| 0.10 μm Polystyrene Beads | Polysciences, Inc. | 00876 | |
| Agarose GPG/LE | American Bioanalytical | 00972 | Ultra pure |
| Falcon 14 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352057 | 17 x 100 mm style, nonpyrogenic |
| Thermo Scientific Plain precleaned microscope slides | Erie Scientific Company | 420-004T | 3″ x 1″ x 1 mm |
| Cover Slips | VWR | 48366 205 | 18 mm x 18 mm No. 1 1/2 |
| KIMTECH Science Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| BD Falcon 100 x 15mm Style Petri Dish | BD Biosciences | 351029 | |
| Tape blank 3/4w x 500L | TimeMed | T-512 | |
| Immersion oil | Nikon | Type A, nd=1.515 | |
| EG1285 or CZ1200 | C. elegans Genetic Center | http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ | |
| OptiScan II | PRIOR Scientific | ||
| NIS-Elements Ar or Br | Nikon | ||
| MicroPoint Ablation Laser System | Photonic Scientific | ||
| Compound microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Hamamatsu Camera | Hamamatsu Photonics | Model C8484-05G01 | |
| Dell Precision T3400 PC with Intel Core 2 Duo | Dell | ||
| Windows XP Professional | Microsoft | Version 2002, Series Pack 3 | |
| Dual dry bath Incubator | Fisher Scientific | Analog controls | |
| 4X Plan Fluor objective | Nikon | ||
| 100X Plan Apo VC oil objective | Nikon | ||
| Dumont #5/45 forceps | Dumont | 11251-35 | Dumoxel standard tips, can also use #7 |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ800 | With NI-150 High Intensity Illuminator |
References
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