A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Summary

Beschrijven we een eenvoudige, snelle methode van het genereren van 3D weefsel-achtige sferoïden en hun potentiële toepassing op verschillen in de cel-cel interacties te kwantificeren.

Abstract

Studies van cel-cel cohesie en cel-substraat adhesie hebben in het verleden zijn uitgevoerd op monolaagculturen aanhanger van stijve substraten. Cellen in een weefsel, maar zijn meestal verpakt in een dicht op elkaar gepakte massa weefsel waarbij de cellen intieme verbindingen tot stand met de vele bijna-buren en met de extracellulaire matrix componenten. Dienovereenkomstig, de chemische milieu en fysieke krachten ervaren door cellen in een 3D-weefsel zijn fundamenteel anders dan die ervaren door cellen gekweekt in monolaag cultuur. Dit is aangetoond dat duidelijk invloed cellulaire morfologie en signalering. Verschillende methoden zijn ontwikkeld om 3D-celculturen waaronder inkapseling van de cellen in collageen gels ¹ of in biomateriaal steigers ² te genereren. Dergelijke methoden, hoewel nuttig, niet herhalen het intieme direct cel-cel adhesie architectuur gevonden in de normale weefsels. Integendeel, zij nauwer bij benadering cultuur-systemen waarin de afzonderlijke cellen zijn losjes verspreid in een 3D-meshwork van ECM-producten. We beschrijven hier een eenvoudige methode waarin cellen zijn geplaatst in opknoping druppel cultuur en geïncubeerd onder fysiologische omstandigheden totdat ze vormen echte 3D-sferoïden waarin de cellen zijn in direct contact met elkaar en met de extracellulaire matrix componenten. De methode vereist geen speciale apparatuur en kan worden aangepast aan de toevoeging van een biologisch middel in zeer kleine hoeveelheden die mogelijk van belang zijn in het ontrafelen van effecten op cel-cel of cel-ECM interacties te nemen. De methode kan ook worden gebruikt om de co-cultuur twee (of meer) verschillende cel populaties om zo de rol van cel-cel of een cel-ECM interacties in het specificeren van ruimtelijke relaties tussen de cellen toe te lichten. Cel-cel cohesie en cel-adhesie ECM zijn de hoekstenen van de studies van de embryonale ontwikkeling, tumor-stromale cel interactie in kwaadaardige invasie, wondgenezing, en voor toepassingen op tissue engineering. Deze eenvoudige methode zal een middel van het genereren van weefsel-achtige cellulaire aggregaten voor het meten van de biomechanische eigenschappen of voor moleculaire en biochemische analyse in een fysiologisch relevante model.

Protocol

1. De voorbereiding van een enkele celsuspensie Hechtende celkweken moeten worden gekweekt tot 90% confluentie, dient waarna monolagen twee keer gespoeld met PBS. Na het aftappen goed, voeg 2 ml (voor 100 mm platen) van 0,05% trypsine-1 mM EDTA, en incubeer bij 37 ° C tot cellen los te maken. Stop trypsinisatie door toevoeging van 2 ml van compleet medium en voorzichtig gebruik van een 5 ml pipet op het mengsel vermaal tot de cellen in suspensie. Overdracht cellen om een ​​15 ml conische buis. …

Discussion

Studies hebben aangetoond dat het kweken van cellen in een drie-dimensionale context (3D) verschillende cellulaire morfologie en signalering in vergelijking met een stijve tweedimensionale (2D) cultuur-systeem ⁹ produceert. Bijvoorbeeld, fibroblast-bevolkte collageen gels aan te tonen dat fibroblasten morfologie in 3D is zeer verschillend van die in 2D ^10,11. Op dezelfde manier kan 3D-cultuur induceren weefsel-specifieke differentiatie van mamma-epitheliale cellen. 3D-cultuur systemen zijn gebruikt…

Materials

• automatic cell counter (BioRad TC10)
• shaking water bath with CO₂ gable cover Model 3540 (Lab-line)