Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D

Summary

Nous décrivons une méthode simple et rapide de générer des tissus 3D-like sphéroïdes et leur application potentielle de quantifier les différences dans les interactions cellule-cellule.

Abstract

Les études sur la cohésion de cellule à cellule et cellule-substrat d'adhérence ont historiquement été réalisées sur des cultures en monocouche adhérente sur des substrats rigides. Cellules dans un tissu, cependant, sont généralement enfermés dans une masse de tissu très dense dans lequel les cellules d'établir des connexions intimes avec de nombreux quasi-voisins et avec des composants de la matrice extracellulaire. En conséquence, le milieu chimique et les forces physiques vécus par les cellules dans un tissu 3D sont fondamentalement différentes de celles vécues par les cellules en culture monocouche. Cela a été démontré que l'impact nettement la morphologie cellulaire et de signalisation. Plusieurs méthodes ont été conçues pour générer des cultures cellulaires en 3D, y compris l'encapsulation des cellules dans ^une des gels de collagène ou biomatériau échafaudages ^2. Ces méthodes, bien qu'utile, ne pas rappeler les intimes architecture Direct adhérence cellule-cellule dans les tissus normaux. Plutôt, ils plus étroitement les systèmes de culture approximative dans laquelle des cellules individuelles sont vaguement dispersés au sein d'un maillage 3D de produits d'ECM. Ici, nous décrivons une méthode simple dans lequel les cellules sont placées dans la culture suspendus baisse et incubés dans des conditions physiologiques jusqu'à ce qu'ils forment vraie sphéroïdes 3D dans lequel les cellules sont en contact direct avec eux et avec les composants de la matrice extracellulaire. La méthode ne nécessite pas d'équipement spécialisé et peut être adapté pour inclure plus d'un agent biologique en très petites quantités qui peuvent être d'intérêt à élucider les effets sur la cellule-cellule ou cellule-ECM interaction. La méthode peut également être utilisé pour la co-culture de deux (ou plusieurs) des populations de cellules différentes, afin d'élucider le rôle des interactions cellule-cellule ou cellule-ECM en précisant les relations spatiales entre les cellules. Cellule-cellule et cellule-cohésion ECM d'adhésion sont les pierres angulaires d'études du développement, de l'interaction de cellules embryonnaires de tumeurs stromales malignes dans l'invasion, la cicatrisation, et pour les applications d'ingénierie tissulaire. Cette méthode simple vous fournir un moyen de générer des tissus tels que les agrégats cellulaires pour la mesure des propriétés biomécaniques ou pour l'analyse moléculaire et biochimique dans un modèle physiologiquement pertinents.

Protocol

1. Préparation d'une suspension cellulaire unique Cultures de cellules adhérentes doivent être cultivés à 90% de confluence, les monocouches quoi doivent être rincés deux fois avec du PBS. Après la vidange bien, ajoutez 2 ml (pour les plaques de 100 mm) de 0,05% de trypsine-1 mM EDTA, et incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se détacher. Arrêtez trypsinisation en ajoutant 2 ml de milieu complet et doucement l'utilisation d'une pipette 5 ml de triturer le mélange jusqu'…

Discussion

Des études ont montré que les cellules en culture dans un contexte en trois dimensions (3D) produit distinctes morphologie cellulaire et de signalisation par rapport à une démarche rigide en deux dimensions du système de culture (2D) ^9. Par exemple, des gels de collagène des fibroblastes peuplées de démontrer que la morphologie des fibroblastes en 3D est tout à fait distincte de celle observée en 2D ^10,11. De même, la culture 3D peut induire tissu-spécifique de différenciation des cell…

Materials

• automatic cell counter (BioRad TC10)
• shaking water bath with CO₂ gable cover Model 3540 (Lab-line)