Простые висячей капли культуре клеток Протокол Генерация 3D сфероидов
Summary
Мы опишем простой, быстрый способ получения 3D-ткани, как сфероиды и их потенциальное использование количественного различия в межклеточных взаимодействиях.
Abstract
Исследование межклеточных сплоченности и клеточного субстрата адгезии исторически были выполнены на однослойной культуре приверженцем жестких носителях. Клетки в тканях, однако, как правило, заключенная в плотно упакованной массы тканей, при котором клетки создания интимной связи со многими почти соседями и компонентов внеклеточного матрикса. Соответственно, среда химические и физические силы испытывают клетки в 3D ткани принципиально иные, чем те испытывают клеток, выращенных в монослой культуры. Это было показано, что заметно влияние клеточной морфологии и сигнализации. Несколько методов было разработано для создания 3D-культур клеток, включая инкапсуляции клеток в коллаген гели 1 или в биоматериала лесов 2. Такие методы, в то время как полезные, не повторять интимных прямой межклеточной адгезии архитектуры находится в нормальных тканях. Скорее, они больше приближены системы культуры, в которой отдельные клетки слабо диспергированы в 3D-сети из продуктов ECM. Здесь мы опишем простой метод, при котором клетки помещаются в висячей капли культуры и инкубировали в физиологических условиях, пока они не образуют истинные 3D сфероидов, в которой клетки находятся в непосредственном контакте друг с другом и с компонентов внеклеточного матрикса. Метод не требует специального оборудования и может быть адаптирован для включения добавления каких-либо биологического агента в очень малых количествах, которые могут представлять интерес для выяснения влияния на межклеточной или клеточной ECM взаимодействия. Метод может быть также использована для совместного культуры двух (или более) различных клеточных популяций, чтобы выяснить роль межклеточных или клеточно-ECM взаимодействий в определении пространственных отношений между ячейками. Cell-ячейки сплоченности и клеточной адгезии ECM являются краеугольным камнем исследования эмбрионального развития, опухоли стромальных клеток взаимодействия в злокачественные вторжения, заживление ран, а также для приложений к тканевой инженерии. Этот простой метод обеспечит средство получения ткани, как сотовые заполнители для измерения биомеханических свойств или молекулярные и биохимические анализы в физиологически соответствующие модели.
Protocol
Discussion
Исследования показали, что культивирование клеток в трехмерном контексте (3D) производит различные клеточной морфологии и сигнализации по сравнению с жесткой двумерной (2D) системе культуры 9. Например, фибробластов населенных гели коллагена показывают, что фибробласты морфологи?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор хотел бы поблагодарить д-ра Dongxuan Цзя для оказания технической помощи. Некоторые из изображений, входящих в этой статье, были в сотрудничестве с доктором Малкольмом С. Штейнберг, кафедра молекулярной биологии Принстонского университета. Автор также хотел бы поблагодарить Министерство обороны рака простаты Программа исследований (гранты PC-030 482 и PC-991 552) и NCI / NIH (грант R01CA118755) за их щедрую поддержку.
Materials
- automatic cell counter (BioRad TC10)
- shaking water bath with CO2 gable cover Model 3540 (Lab-line)
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
- Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. Germ-layer surface tensions and "tissue affinities" in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements. Dev Biol. 192, 630-644 (1997).
- Schotz, E. M. Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning. HFSP J. 2, 42-56 (2008).
- Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Dev Biol. 278, 255-263 (2005).
- Li, D. Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle. J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).
- Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122, 1611-1620 (1996).
- Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing. Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).
- Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts. Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).
- Grinnell, F. Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices. Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).
- Wang, F. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).
- Weaver, V. M. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).
- Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells. J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).
- Bissell, M. J. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
- Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).
- Napolitano, A. P. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43, 494-496 (2007).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).
