कोशिकाओं के वयस्क Zebrafish की किडनी में सीधे प्रत्यारोपण

Summary

सेल प्रत्यारोपण ऊतक उत्थान के अध्ययन के लिए और रोग के सेल आधारित चिकित्सा के विकास के लिए आवश्यक तकनीक है. हम यहाँ एक microsurgical तकनीक है कि वयस्क zebrafish मछली के गुर्दे में आनुवंशिक रूप से लेबल कोशिकाओं के प्रत्यारोपण सीधे परमिट प्रदर्शित करता है.

Abstract

क्षतिग्रस्त ऊतकों में स्टेम या पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के आधार पर पुनर्योजी चिकित्सा जीर्ण ¹ रोगों के एक विस्तृत रेंज का इलाज करने की क्षमता है. हालांकि, ज्यादातर अंगों को आसानी से सुलभ नहीं हैं शल्य चिकित्सा पद्धतियों को विकसित करने के लिए इन संरचनाओं के लिए पहुँच प्राप्त करने की आवश्यकता की जरूरत महसूस. इस वीडियो लेख में, हम वयस्क zebrafish, उत्थान और ² रोग का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल के गुर्दे में सीधे कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए एक विधि का वर्णन. प्राप्तकर्ता मछली इंजेक्शन ³ कोशिकाओं के प्रतिरक्षा अस्वीकृति को दबाने के लिए विकिरण द्वारा पूर्व वातानुकूलित. हम प्रदर्शन कैसे सिर गुर्दे मछली की दिशा में एक पार्श्व चीरा, अंग में सीधे कोशिकाओं के इंजेक्शन द्वारा पीछा द्वारा उजागर किया जा सकता है है. Fluorescently लेबल पूरे गुर्दे मज्जा गुर्दे और hematopoietic व्यापारियों के एक मिश्रित आबादी शामिल कोशिकाओं का उपयोग, हम बताते हैं कि टीका लगाना नेफ्रॉन progenitors और नए गुर्दे ऊतक में अंतर कर सकते हैं – किसी भी सेल आधारित पुनर्योजी चिकित्सा के सोने के मानक. इस तकनीक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गुर्दे और अन्य आंतरिक अंगों के लिए स्टेम या पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और / या छोटे अणुओं शुद्ध और आगे पुनर्योजी चिकित्सा अध्ययन के लिए एक बहुमुखी मॉडल के रूप में zebrafish बढ़ाता है उद्धार करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Protocol

1. गैर ट्रांसजेनिक प्राप्तकर्ता मछली की कंडीशनिंग. प्रत्यारोपण के लिए सबसे बड़ी व्यवस्था में पुरुष मछली का चयन करें. लगभग 3 मिनट के लिए या जब तक यह बंद हो जाता है तैराकी, लेकिन लंबे समय है कि दिल की धड़कन बंद हो जाता है नहीं तो 0.02% Tricaine में मछली (7 पीएच) रखें. एक बेंच शीर्ष पर एक नम कागज तौलिया पर anesthetized मछली रखो. एक इंसुलिन सिरिंज सुई के प्रयोग के लिए पानी की 20 उल में मछली की intraperitoneal गुहा में gentamicin की 40 स्नातकीय इंजेक्षन. गुर्दे उत्थान के अध्ययन के लिए, इस कदम बढ़ाया engraftment के लिए एक अनुकूल वातावरण उत्प्रेरण के लिए महत्वपूर्ण है. मछली वापस वसूली के लिए सिस्टम पानी में रखो. मछली विनम्र और बहुत कंपन के रूप में इस तरह के बाहरी उत्तेजना के प्रति संवेदनशील हो सकता है. वसूली के 3 घंटे के बाद, गामा विकिरण का 25 ग्रे के साथ मछली का इलाज. पहले प्रत्यारोपण के लिए भोजन के बिना 3 दिनों के लिए वापस प्रणाली में मछली रखो. 2. पूर्वज दाता कोशिकाओं की तैयारी आनुवंशिक एक फ्लोरोसेंट मार्कर (EGFP या mCherry) के साथ लेबल. बस शल्य प्रक्रिया से पहले, दाता कोशिकाओं को प्रत्यारोपित किया जा तैयार और उन्हें बर्फ पर रख. ट्रांसजेनिक लाइन है, जो गुर्दे और hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं होते हैं: गुर्दे की पढ़ाई के लिए, हम टीजी (EGFP cdh17) से पूरे गुर्दे मज्जा की कोशिकाओं का उपयोग करें. इन पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं आनुवंशिक रूप में चिह्नित कर रहे हैं और केवल EGFP व्यक्त करेंगे अगर वे टीका लगाना और गुर्दे की उपकला कोशिकाओं में अंतर है. Angioblast progenitors प्रत्यारोपण के लिए: hematopoietic स्टेम सेल या टीजी (EGFP fli1a) के लिए: लेबल पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के अन्य प्रकार भी टीजी (EGFP SCL) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है,. उन्हें 5 मिनट के लिए 0.2% Tricaine में रखकर 3 वयस्क ट्रांसजेनिक मछली euthanize. एक निष्फल धार प्रयोग के सिर और पूंछ, और कैंची विदारक को दूर करने के लिए उदर पक्ष के साथ एक midline चीरा बनाने के लिए. स्टिरियोस्कोप के तहत, शरीर गुहा में चिमटी के साथ तैरना मूत्राशय सहित आंतरिक अंगों के सभी को हटा दें. गुर्दे की है, जो एक फ्लैट और pigmented अंग गुहा के पृष्ठीय दीवार से जुड़ी है को हटाने में सावधान नहीं रहो. अगला, पृष्ठीय दीवार से बाहर गुर्दे काटना और यह एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ठंड फॉस्फेट बफर खारा 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (1X पीबीएस 2 /% FCS) के साथ पूरक के 300 उल युक्त ट्यूब में जगह. कतरनी गुर्दे के लिए एक पैर का उपयोग करें जब तक यह homogenized हो जाता है. एक 50 एमएल फाल्कन ट्यूब के अंदर एक 40 उम सेल छलनी प्लेस और सेल झरनी के शीर्ष पर सेल समाधान हस्तांतरण, ढीला कोशिकाओं के माध्यम से फाल्कन ट्यूब में फ़िल्टर करने के लिए अनुमति देता है. धीरे ऊतक कि झरनी पर छोड़ दिया जाता है करने के लिए आगे कोशिकाओं को तोड़ने के बड़े टुकड़ों स्मियर मूसल का प्रयोग करें. फाल्कन ट्यूब में सेल समाधान छोड़ दो और 1X पीबीएस FCS 2 /% की 1.2 एमएल के साथ झरनी धोने के लिए झरनी से अवशिष्ट कोशिकाओं को इकट्ठा. एक नया 1.5 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस 300 आरसीएफ में 5 मिनट के लिए सेल समाधान स्थानांतरण. 1X पीबीएस FCS 2 /% की 1.5 एमएल के साथ सेल गोली धो और यह एक नया झरनी के माध्यम से पारित करने के लिए चिपचिपा कोशिकाओं के clumps बाहर फिल्टर और फिर अपकेंद्रित्र. Resuspend पीबीएस 1X के 2% / FCS के 200 उल में सेल गोली और एक पीसीआर ट्यूब के लिए स्थानांतरण. पीसीआर ट्यूब (4 डिग्री सेल्सियस, 300 आरसीएफ, 1 मिनट) अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला के सबसे हटा. अवशिष्ट एक 2-5 उल अंतिम मात्रा में मिलता है और यह बर्फ की दुकान पर सतह पर तैरनेवाला में कोशिकाओं Resuspend. अंतिम सेलुलर उपज प्रति गुर्दे लगभग 2 मिलियन कोशिकाओं होना चाहिए. Hemocytometer के साथ कोशिकाओं की संख्या की गणना और 5 के लिए एकाग्रता समायोजित x 10 उल 5 प्रति कोशिकाओं . 3. एक हैमिल्टन सिरिंज में सेल समाधान लोड. हैमिल्टन सिरिंज के साथ बाँझ पानी 3 बार कुल्ला. 3 बार इथेनॉल 75% के साथ सिरिंज कुल्ला. सिरिंज फिर 1X के साथ पीबीएस FCS / 2% 3 बार कुल्ला. फिर सेल समाधान के 1 उल लगभग 5 x 10 5 कोशिकाओं को इंजेक्शन के लिए पहले से होते हैं के साथ सिरिंज लोड. 4. गुर्दे में सीधे पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के प्रत्यारोपण. के बारे में 3 मिनट, या जब तक मछली चलती बंद कर दिया है, लेकिन नहीं भी लंबे समय है कि दिल बंद हो जाता है है की धड़कन के लिए 0.02% Tricaine में वातानुकूलित प्राप्तकर्ता मछली anesthetize. Stereomicroscope के तहत, बाएँ, उदर पक्ष की ओर सिर के साथ एक कागज तौलिया पर मछली करना, क्रम में प्रतिरोपित ओर सूखी. फिर मछली रोल पर सूखे पक्ष का पर्दाफाश. निष्फल चिमटी का प्रयोग, क्षेत्र में तराजू तुरंत गहरे नाले में पीछे हटा दें. एक स्केलपेल के साथ midline पर 1 सेमी इस क्षेत्र में पार्श्व चीरा जबकि चिमटी के साथ ऊतक स्थिर. चिमटी का प्रयोग, ऊतक बेनकाब जबकि चीरा गहरी पर्याप्त जारीसिर गुर्दे का पर्दाफाश. यदि खून बह रहा का एक बहुत है कि गुर्दे के दृश्य रोकता है, मछली euthenize और अन्य प्राप्तकर्ता मछली के साथ शुरू. जबकि ऊतक सिर गुर्दे का पर्दाफाश खुला prying सिर गुर्दे में सीधे सेल समाधान के 1 उल इंजेक्षन. फिर, सिरिंज सुई के रूप में पुनर्प्राप्त किया जा रहा है एक ही समय पर, चिमटी रिलीज इतना है कि ऊतक जगह में गिर जाता है वापस इंजेक्शन कोशिकाओं की लीक को रोकने के. एक सुई ड्राइवर और यह पियर्स के माध्यम से चीरा के प्रत्येक पक्ष पर मांसपेशियों के साथ एक सिवनी सुई पकड़ो. 2 समुद्री मील टाई और अतिरिक्त सिवनी में कटौती. केवल एक ही सिवनी एक 1 सेमी चीरा के लिए की जरूरत है. 5 घंटे के लिए Tricaine के 10 मिलियन प्रति भागों से युक्त एक शांत एनाल्जेसिक प्रभाव के साथ मछली प्रदान मछली पानी में मछली रखें. सिस्टम में वापस सामान्य feedings के साथ वसूली के लिए मछली रखें. वसूली के 7-18 दिनों के बाद, हम मछली काटना और जीना EGFP प्रतिदीप्ति द्वारा गुर्दे पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के engraftment का विश्लेषण. 5. प्रतिनिधि परिणाम: प्रत्यारोपण के समग्र रणनीति चित्रा 1 में सचित्र है. हमारे गुर्दे की पढ़ाई के लिए, गुर्दे और dissected और EGFP प्रतिदीप्ति द्वारा विश्लेषण. Engraftment और गुर्दे की पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की भेदभाव सात दिनों के बाद प्रत्यारोपण के रूप में जल्दी के रूप में पता चला है. इस के एकाधिक समूहों EGFP + गुर्दे की उपकला कोशिकाओं (चित्रा 2) की उपस्थिति से स्पष्ट है. 18 दिनों के बाद प्रत्यारोपण करके, हम 24 EGFP + नेफ्रॉन के एक औसत का पता लगाने, यह दर्शाता है कि दाता कोशिकाओं नए गुर्दे ऊतक का गठन किया है ( चित्रा 3). लंबी अवधि के engraftment प्रदर्शित करने के लिए, हम एक प्राप्तकर्ता मछली 59 दिनों के बाद प्रत्यारोपण (चित्रा 4) dissected. इस मछली दूर साइटों (सफेद arrowheads) में एकाधिक नेफ्रॉन के अलावा में इंजेक्शन के स्थल (लाल arrowhead) में कई नेफ्रॉन था सुझाव है कि गुर्दे की पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं प्रवासी हैं. इस तकनीक जब कोशिकाओं संचलन में दिल है, जो लगभग तीन महीने लगते हैं engraftment का पता लगाने के माध्यम से अंतःक्षिप्त रहे हैं तुलना में तेजी से और अधिक कुशल है. चित्रा 1. प्रत्यारोपण गैर ट्रांसजेनिक. प्राप्तकर्ता मछली की समग्र योजना के लिए प्रतिरोपित कोशिकाओं के प्रतिरक्षा अस्वीकृति को दबाने विकिरणित हैं. तीन दिन बाद, एक चीरा मछली और दाता पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की दिशा पर किया जाता है उजागर सिर गुर्दे में इंजेक्ट कर रहे हैं. चीरा एक सिवनी और मछली के साथ बंद कर दिया है वसूली के लिए प्रणाली में वापस रखा. बाद में समय बिंदुओं पर प्राप्तकर्ता मछली के गुर्दे dissected और engraftment और पूर्वज गतिविधि के लिए विश्लेषण. चित्रा 2. पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के सात दिनों के बाद engraftment. गुर्दे की पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के engraftment सात दिनों के बाद प्रत्यारोपण में सिर गुर्दे के इंजेक्शन तरफ पता चला है, के रूप में EGFP + गुर्दे उपकला कोशिकाओं के समूहों की उपस्थिति (इनसेट – आवर्धित दृश्य) द्वारा निर्धारित है. चित्रा 3. 18 दिनों के बाद पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के engraftment 18 दिनों के बाद प्रत्यारोपण के बाद, हम 24 EGFP के एक औसत + दाता व्युत्पन्न नेफ्रॉन (डालने व्यक्तिगत EGFP + नेफ्रॉन के आवर्धित दृश्य) का पता लगाने. चित्रा 4. Engraftment और 59 दिनों के बाद पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के प्रवास हम करने के लिए पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं प्रत्यारोपण के बाद लंबे समय के engraftment का पता लगाने के बाद भी 59 दिनों (लाल तीर सिर) , जारी रखा. , बाद में इस समय बिंदु पर दाता व्युत्पन्न नेफ्रॉन स्थलों पर पता चला रहे हैं इंजेक्शन (सफेद तीर सिर), पूर्वपुस्र्ष सेल प्रवास के साथ संगत की साइट से दूर है.

Discussion

सेल प्रत्यारोपण तकनीक पुनर्योजी अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं और स्टेम सेल गतिविधि को मापने के लिए सोने के मानक परख रहे हैं. यहाँ, हम वयस्क zebrafish के गुर्दे में सीधे कोशिकाओं का प्रत्यारोपण करने के लिए स्टेम और पूर्वपुस्र्ष सेल गतिविधि का निर्धारण करने के लिए एक विधि रिपोर्ट. यह प्रक्रिया सिर गुर्दे, गुर्दे में सीधे कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद का पर्दाफाश करने के लिए मांसपेशियों के माध्यम से एक चीरा शामिल है. चीरा एक एकल सीवन के साथ बंद कर दिया है और संचालित मछली एक 90-100% जीवित रहने की दर है. हमारे प्रयोगों में, engrafted गुर्दे पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं प्रतिरोपित मछली का 80-100% में सात दिनों के बाद प्रत्यारोपण के द्वारा पता चला रहे हैं. इस तकनीक की एक सीमा है कि चीरा पृष्ठीय महाधमनी है जो आसानी से स्केलपेल द्वारा उठी किया जा सकता है के पास है. हालांकि, एक बार में महारत हासिल है, रक्तस्राव की दर एक प्रतिशत से भी कम के लिए कम किया जा सकता है. हमारे विधि गुर्दे के लिए अन्य कोशिका प्रकार (रक्त, stromal, या संवहनी) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से छोटे अणुओं देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस तकनीक के विकास के अग्रिम पुनर्योजी अध्ययन मदद और vivo में मूल्यांकन करने के लिए स्टेम और पूर्वपुस्र्ष सेल की क्षमता की अनुमति होगी .

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Insulin syringe needle (28 gauge)	Becton Dickinson	329461
Cell strainer (40 uM)	Becton Dickinson	352340
Tricaine	Sigma	A5040
Hamilton syringe (26 gauge)	Sigma	20734
Ethilon suture (size 9-0)	Ethicon	2819G