組換え可溶性GM - CSF受容体を用いてGM - CSF抗体の中和能を推定する無細胞アッセイシステム
Summary
我々は、受容体への顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM – CSF）の結合を推定するために、無細胞受容体結合アッセイをデザインしました。それは、優れた再現性とGM – CSF自己抗体による可溶性GM – CSF受容体αに結合するビオチン化GM – CSFの競合的阻害を評価することを可能にします。
Abstract
背景：これまで、我々はその中和能を示したが、GM – CSF自己抗体の濃度は、自己免疫性肺肺胞タンパク症（PAP）1-3患者の疾患の重症度と相関していたではない。肺におけるGM – CSFの生物活性の廃止は、4,5自己免疫PAPの可能性が高い原因であるとして、それはPAPと各患者の病気の重症度を評価するためのGM – CSF自己抗体の中和能を測定するために期待される。
今までは、GM – CSF自己抗体の中和能は、ヒト骨髄細胞またはGM – CSF 6月8日で刺激TF – 1細胞の増殖阻害を評価することによって評価されている。バイオアッセイ系では、しかしながら、一定の条件で細胞を維持するための技術的な問題に起因する別の研究室からのデータを、比較するだけでなく、信頼性の高いデータを得るためにしばしば問題になります。
目的：無細胞受容体結合アッセイを用いて細胞表面にGM – CSF受容体に結合するGM – CSFを模倣する。
方法：トランスジェニックカイコ技術は、高純度9月13日に組換え可溶性GM – CSF受容体α（sGMRα）のための大規模な量を得るために適用した。組換えsGMRαは、絹のタンパク質に融合されることなく、絹の糸の親水性のセリシン層に含まれていた、従って、我々は容易に中性の水溶液14,15との良好な純度で繭から抽出することができます。幸いなことに、GM – CSFとの結合に不可欠なオリゴ糖の構造は、他の昆虫や酵母によって生成されるものよりも人間のsGMRαの構造に、より類似しています。
結果：無細胞アッセイ系sGMRαを使用しては高い可塑性と信頼性でデータが得られた。 sGMRαにGM – CSF結合を用量依存sGMRαを使って、新しい無細胞アッセイ系は、中和活性の測定のためのより有用であることを示す、TF – 1細胞を用いたバイオアッセイと同様の方法でポリクローナルGM – CSF自己抗体によって阻害されたTF – 1細胞またはヒト骨髄細胞を用いたバイオアッセイ系よりGM – CSF自己抗体の。
結論：我々はGM – CSF自己抗体の中和能を定量化する無細胞アッセイを確立した。
Protocol
1。 sGMRαの生産と精製ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、ヒト胎盤cDNAライブラリーからsGMRαのcDNAを増幅する。 Hisタグ別のPCRによるPCRアンプリコンの3'末端に50塩基のバキュロウイルスポリヘドリン最後の5' – UTR配列と27塩基のコーディングRGSを追加。 プラスミドpMSG1.1MGに増幅されたPCR産物を挿入します。 カイコPND – W1株の卵にpHA3PIGヘルパーのベクトルを?…
Discussion
無細胞アッセイは、優れた再現性と速さとGM – CSF自己抗体の中和能を推定する。 GM – CSF自己抗体または患者の血清IgG分画による結合阻害は、このアッセイにより評価した。データは、無細胞アッセイの結合阻害とそれぞれTF – 1細胞を用いてバイオアッセイの増殖阻害との間の相関を示した。バイオアッセイは、広く利用され、しかし別の施設と我々はこの新しいシステムを使用すること?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は彼らの貴重な貢献のためのK.中垣、博士石井、博士鈴木、A.山形、K. Oofusaに非常に感謝しています。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog # | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
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Citer Cet Article
Urano, S., Tazawa, R., Nei, T., Motoi, N., Watanabe, M., Igarashi, T., Tomita, M., Nakata, K. A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor. J. Vis. Exp. (52), e2742, doi:10.3791/2742 (2011).