En cell gratis analyssystem uppskatta neutraliserande förmåga av GM-CSF antikroppar med hjälp av rekombinant Löslig GM-CSF-receptorn
Summary
Vi konstruerade en cell utan receptorbindning analys för att uppskatta bindningen av granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF) till receptorer. Det ger oss möjlighet att utvärdera kompetitiv hämning av biotinylerad GM-CSF bindning till lösliga GM-CSF receptor alpha av GM-CSF autoantikroppar med utmärkt reproducerbarhet.
Abstract
Bakgrund: Tidigare visade vi att neutraliserande förmåga, men inte den koncentration av GM-CSF autoantikroppar var korrelerad med sjukdomens svårighetsgrad hos patienter med autoimmun pulmonell alveolär proteinosis (PAP) 1-3. Eftersom upphävandet av GM-CSF bioaktivitet i lungan är den troliga orsaken till autoimmuna PAP 4,5, det är lovande att mäta neutraliserande förmåga GM-CSF autoantikroppar för utvärdering av sjukdomens svårighetsgrad hos varje patient med PAP.
Hittills har neutraliserande förmåga GM-CSF autoantikroppar bedömts genom att utvärdera tillväxthämning av mänskliga benmärgsceller eller TF-1 celler stimuleras med GM-CSF 6-8. I bioassay systemet, dock är det ofta problematiskt att få tillförlitliga data samt att jämföra data från olika laboratorier, på grund av tekniska svårigheter att upprätthålla celler i ett konstant tillstånd.
Syfte: Att imitera GM-CSF bindning till GM-CSF receptor på cellens yta med hjälp av cellfria receptor-bindande-analys.
METODER: Transgenic silkesodlingssektorn teknik har tillämpats för att få en stor summa för rekombinanta lösliga GM-CSF receptor alfa (sGMRα) med hög renhet 9-13. Den rekombinanta sGMRα fanns i den hydrofila sericin lager av siden trådar utan att bli smält i siden proteiner, och därmed kan vi enkelt utdrag ur kokonger i god renhet med neutrala vattenlösningar 14,15. Lyckligtvis oligosackarid strukturer, som är avgörande för bindning med GM-CSF, är mer lik den struktur av mänskliga sGMRα än de som produceras av andra insekter eller jäst.
RESULTAT: Den cellfria analyssystem med sGMRα gav data med hög plasticitet och tillförlitlighet. GM-CSF bindning till sGMRα var dosberoende hämmas av polyklonal GM-CSF autoantikroppar på ett liknande sätt som det biologiska testet med TF-1 celler, vilket tyder på att vår nya cellfria analyssystem med sGMRα är mer användbart för mätning av neutraliserande aktivitet av GM-CSF autoantikroppar än bioassay systemet med TF-1 celler eller mänskliga benmärgsceller.
SLUTSATSER: Vi etablerade en cell utan analysen kvantifiera neutraliserande förmåga GM-CSF autoantikroppar.
Protocol
Discussion
Den cellfria analysen uppskattade neutraliserande förmåga GM-CSF autoantikroppar med utmärkt reproducerbarhet och snabbhet. Det bindande hämning av GM-CSF autoantikroppar eller patientens serum IgG fraktioner utvärderades av denna analys. De data som visade ett samband mellan den bindande hämning av cellfria assay och tillväxthämning av biologiska testsystem med TF-1 celler, respektive. Den bioassay har i stor utsträckning utnyttjats, men hyste svårt att jämföra data mellan olika anläggningar och olika punk…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är mycket tacksamma till K. Nakagaki, Dr H. Ishii, Dr K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa för deras värdefulla bidrag.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog # | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5′-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
