Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten
Summary
Een snelle methode om te infiltreren leukocyten te verkrijgen van de muis hersenen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van een continue en discontinue gradiënt Percoll Ficoll gradiënt te selecteren en te zuiveren van de leukocyten-verrijkte laag. Geïsoleerde leukocyten kan dan worden gekenmerkt door flowcytometrische metingen.
Abstract
We beschrijven een methode voor het bereiden van de hersenen infiltreren leukocyten (Bils) van muizen. Laten we zien hoe aan muizen infecteren met murine encephalomyelitis Theiler's virus (TMEV) via een snelle intracraniële injectie techniek en hoe je een leukocyten-verrijkte populatie van infiltrerende cellen uit hele brein te zuiveren. Kortom, muizen zijn verdoofd met isofluraan in een gesloten kamer en zijn de vrije hand ingespoten met een Hamilton spuit in de frontale cortex. Muizen worden dan gedood op verschillende tijdstippen na infectie door isofluraan een overdosis en de hele hersenen worden geëxtraheerd en gehomogeniseerd in RPMI met een tissue Tenbroeck slijpmachine. Hersenhomogenaten worden gecentrifugeerd door middel van een continu 30% Percoll helling aan de myeline en de andere cel vuil te verwijderen. De celsuspensie wordt vervolgens gespannen op 40 um, gewassen en gecentrifugeerd op een discontinue Ficoll-Paque Plus gradiënt te selecteren en te zuiveren van de leukocyten. De leukocyten worden vervolgens gewassen en geresuspendeerd in de juiste buffers voor immunofenotypering door flowcytometrie. Flowcytometrie onthult een populatie van aangeboren immuuncellen in de vroege stadia van de infectie in C57BL / 6 muizen. Na 24 uur na infectie, meerdere subsets van immuuncellen aanwezig zijn in de Bils, met een verrijkte bevolking van Gr1 +, CD11b + en F4/80 + cellen. Daarom is deze methode is handig in het karakteriseren van de immuunrespons tegen acute infectie in de hersenen.
Protocol
Discussion
We routinematig gebruik van flowcytometrie om zowel de kwaliteit van de hersenen infiltreren celpreparaat te bepalen, en om verschillende populaties van immuuncellen 2, 9 onderscheiden. Bij acute time-punten, onze Bils methode levert hoge percentages van inflammatoire monocyten binnen de CD45hi bevolking, evenals hoge percentages van macrofagen in de CD45lo bevolking. Dit geeft aan dat een reproduceerbare immuunrespons in de hersenen robuust kan worden gekenmerkt door onze methode.
<p class="jove_content"…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidie NS64571 van de NINDS (CLH), door een vroege loopbaanontwikkeling prijs van de Mayo Clinic (CLH), en door een gulle gift van Donald en Frances Herdrich (CLH). We willen de Mayo Clinic Flow Cytometry Core bedanken voor hulp.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
- Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
- Donovan, J., &, P. . B. r. o. w. n., , P. Euthanasia. Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).
- Donovan, J., Brown, P. Handling & restraint. Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).
- Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
- Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
- Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
