Isolement du cerveau infiltrant Leucocytes
Summary
Une méthode rapide pour obtenir leucocytes infiltrants du cerveau murin est décrite. Cette méthode utilise un gradient de Percoll continue et gradient de Ficoll discontinu pour sélectionner et purifier la couche leuco-enrichi. Leucocytes isolés peuvent alors être caractérisées par des mesures de cytométrie en flux.
Abstract
Nous décrivons une méthode pour la préparation de leucocytes infiltrant le cerveau (Bils) de souris. Nous démontrons comment infecter des souris avec le virus murin de Theiler encéphalomyélite (TMEV) via une technique d'injection intracrânienne rapide et comment purifier une population leucocytaire enrichi des cellules infiltrant du cerveau entier. Brièvement, les souris sont anesthésiés à l'isoflurane dans une chambre fermée et sont main-libre injecté avec une seringue Hamilton dans le cortex frontal. Les souris sont ensuite tués à différents moments après l'infection par surdose isoflurane et cerveaux entiers sont extraits et homogénéisé dans du RPMI avec un broyeur de tissus Tenbroeck. Homogénats de cerveaux sont centrifugés à travers un gradient de Percoll à 30% continue d'éliminer les débris cellulaires et d'autres myéline. La suspension cellulaire est alors tendu à 40 um, lavés et centrifugés sur un discontinu de Ficoll-Paque plus dégradé à sélectionner et à purifier les leucocytes. Les leucocytes sont ensuite lavées et resuspendues dans des tampons appropriés pour l'immunophénotypage par cytométrie en flux. La cytométrie en flux révèle une population de cellules immunitaires innées aux stades précoces de l'infection chez les souris C57BL / 6. A 24 heures après l'infection, multiples sous-ensembles de cellules immunitaires sont présentes dans le Bils, avec une population enrichie de Gr1 +, CD11b + et + F4/80 cellules. Par conséquent, cette méthode est utile pour caractériser la réponse immunitaire à une infection aiguë dans le cerveau.
Protocol
Discussion
Nous utilisons régulièrement la cytométrie en flux pour déterminer la qualité de la préparation des cellules du cerveau infiltrer, et de distinguer les différentes populations de cellules immunitaires 2, 9. A aiguë du temps des points, notre méthode Bils rendements des pourcentages élevés de monocytes inflammatoires au sein de la population CD45hi ainsi que de forts pourcentages de macrophages dans la population CD45lo. Cela indique que la réponse immunitaire dans reproductibles le cerveau peut ê…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention NS64571 du NINDS (CLH), par une sentence de développement en début de carrière de la Mayo Clinic (CLH), et par un généreux don de Donald et Frances Herdrich (CLH). Nous tenons à remercier la Clinique Mayo de débit de base de cytométrie de l'aide.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
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