Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten
Summary
Ein schnelles Verfahren zur Infiltration von Leukozyten aus dem murinen Gehirns zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode verwendet einen kontinuierlichen und diskontinuierlichen Percoll-Gradienten Ficollgradienten auszuwählen und zu reinigen, die Leukocyten-angereicherte Schicht. Isolierte Leukozyten kann dann durch durchflusszytometrische Messungen charakterisiert werden.
Abstract
Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung Gehirn infiltrieren Leukozyten (Bils) von Mäusen. Wir zeigen, wie man Mäuse mit Mäuse-Enzephalomyelitis Theiler ist Virus (TMEV) infizieren über eine schnelle intrakraniellen Injektionstechnik und wie man eine Leukocyten-angereicherte Population von infiltrierenden Zellen aus ganzen Gehirn zu reinigen. Kurz gesagt, werden die Mäuse mit Isofluran in einer geschlossenen Kammer und sind frei Hand injiziert mit einer Hamilton-Spritze in den frontalen Kortex. Mäuse werden dann zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion mit Isofluran Überdosierung und ganze Gehirn getötet werden extrahiert und in RPMI homogenisiert mit einem Tenbroeck Gewebe Mahlwerk. Hirnhomogenaten werden durch eine kontinuierliche 30% Percoll-Gradienten zentrifugiert, um das Myelin und andere Zelltrümmer zu entfernen. Die Zellsuspension wird dann bei 40 um angespannt, gewaschen und zentrifugiert auf eine diskontinuierliche Ficoll-Paque Plus-Gradienten zu wählen und reinigen die Leukozyten. Die Leukozyten werden dann gewaschen und in entsprechenden Puffern für Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie. Durchflusszytometrie zeigt eine Bevölkerung von angeborenen Immunzellen in den frühen Stadien der Infektion in C57BL / 6 Mäusen. Nach 24 Stunden nach der Infektion, werden mehrere Untergruppen von Immunzellen in der Bils, mit einer angereicherten Population von Gr1 +, CD11b + und F4/80 + Zellen. Daher ist diese Methode zur Charakterisierung der Immunantwort auf eine akute Infektion in das Gehirn.
Protocol
Discussion
Wir verwenden routinemäßig Durchflusszytometrie, um sowohl die Qualität des Gehirns infiltriert Zellpräparation zu bestimmen und verschiedene Populationen von Immunzellen 2, 9 zu unterscheiden. Bei akuten Zeit-Punkte, ergibt unsere Bils Methode ein hoher Prozentsatz der inflammatorischen Monozyten in der CD45hi Bevölkerung sowie ein hoher Prozentsatz der Makrophagen in der CD45lo Bevölkerung. Dies deutet darauf hin, dass eine reproduzierbare Immunantwort im Gehirn robust können mit unserer Methode char…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Grant NS64571 aus dem NINDS (CLH) unterstützt wird, durch eine frühzeitige Career Development Award von der Mayo Clinic (CLH), und durch ein großzügiges Geschenk von Donald und Frances Herdrich (CLH). Wir möchten die Mayo Clinic Durchflusszytometrie Core for Unterstützung danken.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
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