בידוד של המוח, שחדר Leukocytes
Summary
שיטה מהירה להשיג leukocytes חדירה מהמוח Murine מתואר. שיטה זו מנצלת שיפוע Percoll רציפה שיפוע Ficoll רציפה כדי לבחור ולטהר את שכבת ליקוציט מועשר. Leukocytes מבודד ואז עלול להיות מאופיין על ידי מדידות זרימת cytometric.
Abstract
אנו מתארים שיטה להכנת leukocytes המוח הסתננות (BILs) מעכברים. אנו מדגימים כיצד להדביק עכברים עם Encephalomyelitis Murine Theiler של הנגיף (TMEV) באמצעות טכניקת ההזרקה מהירה תוך גולגולתי ואיך לטהר אוכלוסייה ליקוציט מועשר של תאים שחדרו מן המוח כולו. בקצרה, בעכברים מורדמים עם isoflurane בתא סגור חופשיים יד מוזרק בעזרת מזרק המילטון לתוך קליפת המוח הקדמית. עכברים נהרגים אז לאחר ההדבקה באמצעות מנת יתר isoflurane והמוח כולו בזמנים שונים המחולצים, ומעורים ב RPMI עם מטחנת רקמה Tenbroeck. Homogenates המוח הם centrifuged דרך שיפוע Percoll רציפה של 30% כדי להסיר את פסולת התא המיאלין אחרים. ההשעיה התא הוא מתוח אז 40 מיקרומטר, שטף centrifuged על שיפוע רציפה פלוס Ficoll-Paque לבחור ולטהר את לויקוציטים. Leukocytes נשטפים אז resuspended ב buffers מתאים immunophenotyping ידי cytometry הזרימה. Cytometry זרימה מגלה אוכלוסייה של תאים חיסוניים מולדים בשלבים המוקדמים של דלקת בעכברים C57BL / 6. ב 24 שעות שלאחר זיהום, תת מרובות של תאים חיסוניים נמצאים BILs, עם האוכלוסייה העשירה של Gr1 + + ו CD11b F4/80 + תאים. לכן, שיטה זו שימושית המאפיינת את התגובה החיסונית דלקת חדה במוח.
Protocol
Discussion
אנו משתמשים באופן שגרתי cytometry זרימה כדי לקבוע את איכות ההכנה שחדר המוח תא, להבדיל אוכלוסיות שונות של תאים חיסוניים 2, 9. בשלב נקודות חריפה, שיטה BILs שלנו תשואות באחוזים גבוהים של מונוציטים דלקתי בתוך האוכלוסייה CD45hi כמו גם באחוזים גבוהים של מקרופאגים באוכלוסייה CD45l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NS64571 מן NINDS (CLH), על ידי בפרס פיתוח קריירה מוקדמת ממרפאת מאיו (CLH), ועל ידי מתנה נדיבה של דונלד פרנסיס Herdrich (CLH). ברצוננו להודות תזרים מרפאת מאיו Core cytometry לסיוע.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
- Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
- Donovan, J., &, P. . B. r. o. w. n., , P. Euthanasia. Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).
- Donovan, J., Brown, P. Handling & restraint. Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).
- Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
- Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
- Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
