ब्रेन - घुसपैठ leukocytes के अलगाव
Summary
एक तेजी से विधि murine मस्तिष्क से घुसपैठ leukocytes प्राप्त वर्णित है. इस पद्धति का इस्तेमाल एक सतत Percoll ढाल और असंतत Ficoll का चयन करने के लिए और ढाल परत ल्युकोसैट समृद्ध शुद्ध. पृथक leukocytes तो प्रवाह cytometric माप द्वारा विशेषता जा सकता है.
Abstract
हम चूहों से मस्तिष्क घुसपैठ leukocytes (BILs) की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन. हम प्रदर्शन कैसे एक तेजी से intracranial इंजेक्शन तकनीक और कैसे पूरे दिमाग से घुसपैठ कोशिकाओं की ल्युकोसैट समृद्ध आबादी को शुद्ध के माध्यम से Theiler murine Encephalomyelitis वायरस (TMEV) के साथ चूहों को संक्रमित करने के लिए. संक्षेप में, चूहों के साथ एक कक्ष में बंद कर दिया isoflurane anesthetized हैं और मुक्त हाथ ललाट प्रांतस्था में एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ अंतःक्षिप्त. चूहे तो isoflurane अधिक मात्रा और पूरे दिमाग से संक्रमण के बाद विभिन्न समय पर मारे गए हैं और निकाले homogenized RPMI में एक Tenbroeck ऊतक बनाने की मशीन के साथ. ब्रेन homogenates एक सतत 30% Percoll ढाल के माध्यम से centrifuged माइलिन और अन्य सेल मलबे को हटाने के. सेल निलंबन 40 सुक्ष्ममापी में फिर तनावपूर्ण है, धोया और एक असंतत ढाल Ficoll Paque प्लस पर centrifuged leukocytes का चयन करने के लिए और शुद्ध. leukocytes और फिर धो रहे हैं प्रवाह cytometry द्वारा immunophenotyping के लिए उपयुक्त बफ़र्स में resuspended. प्रवाह cytometry C57BL 6 / चूहों में संक्रमण के प्रारंभिक चरणों में सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आबादी का पता चलता है. 24 घंटे के बाद संक्रमण से कम, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कई सबसेट BILs में मौजूद GR1 +, CD11b + और F4/80 + कोशिकाओं के एक समृद्ध आबादी के साथ, कर रहे हैं. इसलिए, इस विधि मस्तिष्क में तीव्र संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया निस्र्पक में उपयोगी है.
Protocol
Discussion
हम नियमित रूप से प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क सेल घुसपैठ की तैयारी के दोनों गुणवत्ता निर्धारित, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं 2, 9 के विभिन्न आबादी भेद. तीव्र – समय अंक में, हमारे BILs विधि CD45hi के रूप ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NINDS (CLH) से NS64571 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, मेयो क्लीनिक (CLH) से एक प्रारंभिक कैरियर विकास पुरस्कार द्वारा, और डोनाल्ड और फ्रांसिस Herdrich (CLH) से एक उदार उपहार के द्वारा. हम सहायता के लिए मेयो क्लीनिक फ्लो Cytometry कोर धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
- Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
- Donovan, J., &, P. . B. r. o. w. n., , P. Euthanasia. Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).
- Donovan, J., Brown, P. Handling & restraint. Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).
- Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
- Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
- Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
