Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti
Summary
Un metodo rapido per ottenere leucociti infiltrati dal cervello murino è descritto. Questo metodo utilizza una pendenza costante Percoll e gradiente discontinuo di Ficoll selezionare e purificare i leucociti arricchito strato. Leucociti isolati può quindi essere caratterizzata da misure di citometria a flusso.
Abstract
Descriviamo un metodo per la preparazione di leucociti cervello infiltrante (Bils) dai topi. Noi dimostrare come infettare topi con encefalomielite Theiler ha murino virus (TMEV) attraverso una tecnica rapida iniezione intracranica e come purificare un leucociti arricchito popolazione di cellule infiltrati dalla intero cervello. In breve, i topi vengono anestetizzati con isoflurano in una camera chiusa e sono a mano libera iniettato con una siringa Hamilton nella corteccia frontale. I topi sono poi uccisi in vari momenti dopo l'infezione da overdose isoflurano e cervelli interi vengono estratti e omogeneizzato in RPMI con una smerigliatrice tessuto Tenbroeck. Omogenati cerebrali sono centrifugate con una pendenza costante Percoll 30% per rimuovere i detriti cellulari mielina e gli altri. La sospensione cellulare viene quindi filtrato a 40 micron, lavato e centrifugato su un discontinuo Ficoll-Paque Plus. gradiente di selezionare e purificare i leucociti. I leucociti vengono poi lavate e risospese in buffer appropriato per immunofenotipizzazione mediante citometria di flusso. Citometria a flusso rivela una popolazione di cellule del sistema immunitario innato nelle fasi precoci dell'infezione nei topi C57BL / 6. A 24 ore dopo l'infezione, più sottoinsiemi di cellule immunitarie sono presenti nel Bils, con una popolazione arricchita del Gr1 +, CD11b F4/80 + + e cellule. Pertanto, questo metodo è utile per caratterizzare la risposta immunitaria alle infezioni acute del cervello.
Protocol
Discussion
Noi abitualmente uso di citometria a flusso per determinare sia la qualità della preparazione infiltrazione delle cellule cerebrali, e per distinguere le diverse popolazioni di cellule immunitarie 2, 9. Al acuta intervalli di tempo, il nostro metodo Bils rese elevate percentuali di monociti infiammatorio all'interno della popolazione CD45hi così come alte percentuali di macrofagi nella popolazione CD45lo. Ciò indica che una risposta immunitaria riproducibile all'interno del cervello possono essere …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione NS64571 dal NINDS (CLH), con un premio primi stadi dello sviluppo della carriera della Mayo Clinic (CLH), e da un generoso regalo di Donald e Frances Herdrich (CLH). Vorremmo ringraziare il Core Mayo Clinic Citometria a flusso per l'assistenza.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
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